同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析煙氣中性香味成分

賈春曉，黃備備，楊鵬飛，陳芝飛，席高磊，毛多斌

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院煙草科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000)

卷煙降焦會導(dǎo)致煙氣中香氣傳輸量減少，為突出卷煙的特征香韻，加香成為提高香煙產(chǎn)品質(zhì)量的重要手段。加香或補香必須以煙氣中的香味成分及其含量為基礎(chǔ)[1]，所以分析測定煙氣中香味成分，尤其是對香氣有較大影響的中性成分含量具有重要意義。

目前，已有較多關(guān)于煙氣香味成分的分離鑒定和半定量分析的報道[2-6]，但是存在樣品前處理過程繁瑣、定量分析誤差較大等問題[7]。關(guān)于定量分析，有報道采用半制備高效液相色譜結(jié)合 GC/MS法測定某品牌成品卷煙煙氣中性香味成分[8-9]，與直接采用 GC/MS法[10-11]相比，該方法在測定的中性香味成分?jǐn)?shù)量，方法的靈敏度和準(zhǔn)確度等方面均有提高，但某些痕量香味成分，如香葉基丙酮和β-紫羅蘭酮等，在復(fù)雜的分離除雜過程中有損失，回收率較低，影響了這些關(guān)鍵致香成分含量的準(zhǔn)確測定。由于煙氣的化學(xué)成分復(fù)雜，受基質(zhì)效應(yīng)的制約，在可獲得標(biāo)記目標(biāo)化合物的情況下，穩(wěn)定同位素稀釋分析 (SIDA) 是消除定量分析過程中基質(zhì)效應(yīng)影響最有效的方法[12]。SIDA 在食品和醫(yī)藥的成分測定中已有較多應(yīng)用[13-18]，但同位素作為內(nèi)標(biāo)物，旨在排除基質(zhì)效應(yīng)、提高定量分析準(zhǔn)確度，而同位素標(biāo)記物在化合物定性分析方面的應(yīng)用則少有報道。煙氣中很多重要的香氣成分在進行色譜分離時干擾嚴(yán)重，定性和定量分析均有較大難度。利用同位素分子離子及帶同位素原子的特征碎片離子的標(biāo)記作用，并配合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進行定性分析，在此基礎(chǔ)上，利用同位素內(nèi)標(biāo)校正基質(zhì)效應(yīng)對煙氣中痕量香味成分進行定量分析，將大大提高定性分析的可靠性和定量分析的準(zhǔn)確性。

本研究擬采用同時蒸餾萃取法提取煙氣中性香味成分，應(yīng)用 SIDA 技術(shù)結(jié)合 GC/MS 法對煙氣中的 10 種關(guān)鍵痕量中性香味成分進行定性和定量分析，旨在為復(fù)雜基質(zhì)中痕量成分的定性和定量分析提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

市售成品卷煙，編號為 1～4；單料卷煙，編號為 5～16；黃金葉某品牌成品卷煙。各品種卷煙煙支長度均為84 mm，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供；進口劍橋濾片，Φ=92 mm。

二氯甲烷(色譜純)、36%鹽酸、氫氧化鈉(分析純)：均為天津市凱通公司產(chǎn)品；無水硫酸鈉(分析純)：煙臺市雙雙化工有限公司產(chǎn)品。

苯甲醛(編號1#，純度99%)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(編號2#，純度98%)、乙酸糠酯(編號3#，純度99%)、苯甲酸甲酯(編號4#，純度99%)、異氟爾酮(編號5#，純度97%)、2,4-二甲基苯乙酮(編號6#，純度95%)、2-十一酮(編號7#，純度98%)、香葉基丙酮(編號8#，純度98%)、β-紫羅蘭酮(編號9#，純度95%)和苯甲酸芐酯(編號10#，純度99%)標(biāo)準(zhǔn)品：均為百靈威科技有限公司產(chǎn)品。

D5-苯甲醛(編號1′#，純度99%)、D8-異氟爾酮(編號5′#，純度98%)穩(wěn)定同位素標(biāo)記物：均為美國Sigma公司產(chǎn)品；13C3-6-甲基-5-庚烯-2-酮(編號2′#，純度95%)、D3-乙酸糠酯(編號3′#，純度99%)、D5-苯甲酸甲酯(編號4′#，純度99%)、D3-2,4-二甲基苯乙酮(編號6′#，純度98%)、13C3-2-十一酮(編號7′#，純度99%)、13C3-香葉基丙酮(編號8′#，純度95%)、D4-β-紫羅蘭酮(編號9′#，純度95%)和D5-苯甲酸芐酯(編號10′#，純度99%)穩(wěn)定同位素標(biāo)記物：均由本實驗室通過化合制得，純度經(jīng)HPLC法檢測，結(jié)構(gòu)經(jīng)紅外光譜、核磁共振譜、多級質(zhì)譜及高分辨質(zhì)譜確證。

RM20H轉(zhuǎn)盤式自動吸煙機：德國Borgwaldtkc公司產(chǎn)品；WB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；GC 7890-MS 5977 B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；電子天平(感量0.000 01 g)：瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；同時蒸餾萃取儀：上海華科公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取23.01、17.10、14.21、14.17、13.92、17.05、18.30、19.51、12.53、34.14 mg編號為1#～10#的化合物于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解、定容，配制成10種香味化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(計算化合物濃度時，稱取量用各自純度進行校正)，于2～4 ℃保存，備用。

相應(yīng)的10種同位素標(biāo)記物混標(biāo)儲備液的制備：分別準(zhǔn)確稱取20.97、10.29、16.14、5.24、8.92、14.23、8.17、15.25、9.53、16.86 mg編號為1′#～10′#的同位素標(biāo)記物于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解、定容，配制成相應(yīng)的10種同位素標(biāo)記物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(計算化合物濃度時，稱取量用各自純度進行校正)，于2～4 ℃保存，備用。

10種香味化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：分別準(zhǔn)確移取0.01、0.05、0.10、0.15、0.50、1.50、2.50、5.00 mL 10種香味化合物混標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中，再分別加入1.00 mL 10種目標(biāo)化合物的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物混標(biāo)儲備液，用二氯甲烷定容，配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，待測。

1.2.2樣品前處理 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19609—2004在RM 20H轉(zhuǎn)盤式自動吸煙機上對20支卷煙進行抽吸，采用劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣總粒相物(TPM)。抽吸完畢后，采用同時蒸餾萃取法，以二氯甲烷為萃取劑萃取劍橋濾片上捕集的TPM中的香味成分，得到二氯甲烷萃取液。然后,分別用5%鹽酸溶液(體積百分比，下同)和5%氫氧化鈉溶液洗滌,除去萃取液中的堿性和酸性成分，得到中性香氣成分萃取液。向萃取液中加入無水硫酸鈉，冷藏、干燥、過夜，并濃縮至1.0 mL，得到中性成分濃縮液，待測。與文獻[8]的樣品前處理方法相比，該方法不需要用半制備HPLC將其分離為3個餾分，可以直接進行GC/MS分析，樣品用量由200支卷煙減少到20支卷煙，縮短了分析時間，簡便易行。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：HP-5 MS毛細(xì)管柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；載氣：高純氦氣，純度為99.999%，流速1.0 mL/min；進樣口溫度280 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持4 min；以1 ℃/min升至57 ℃，保持6 min；以2 ℃/min升至72 ℃，保持7 min；以1 ℃/min升至84 ℃，保持6 min；以1 ℃/min升至90 ℃，保持5 min；以3 ℃/min升至110 ℃，再以1 ℃/min升至120 ℃，保持3 min；以3 ℃/min升至147 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升至163 ℃，保持5 min；以4 ℃/min升至240 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 定性和定量分析時分別選擇全掃描(SCAN)和選擇離子監(jiān)測(SIM)模式；電子轟擊(EI)源溫度280 ℃，接口溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子倍增器電壓2.28 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500，溶劑延遲時間8 min。各化合物的定性和定量離子列于表1。

表1 10種香味化合物及其相應(yīng)同位素標(biāo)記物的定性和定量離子Table 1 Qualitative and quantitative ions of 10 aromatic components and respective isotope markers

2 結(jié)果與討論

2.1 GC/MS條件的優(yōu)化

本研究旨在對定量分析中回收率較低的痕量中性香味成分的含量進行準(zhǔn)確測定?；厥章实偷闹饕蚴菢悠非疤幚磉^程復(fù)雜、基質(zhì)效應(yīng)影響較大，本研究在文獻[8]的基礎(chǔ)上，選擇10種回收率較低的痕量中性香味成分，簡化樣品前處理過程，使中性待測液不經(jīng)過半制備HPLC分離，直接采用GC/MS法分離分析，同時也減少了卷煙樣品的用量。由于煙氣中性成分復(fù)雜，本研究進一步優(yōu)化了GC/MS分析條件，對色譜柱和升溫速率進行考察，最終確定了1.3節(jié)的實驗條件，該條件下，各目標(biāo)化合物與干擾成分之間可得到基本分離。

2.2 10種目標(biāo)化合物的定性分析和定性定量離子的選擇

由于采用了穩(wěn)定同位素稀釋分析技術(shù)，同位素內(nèi)標(biāo)的加入不僅可以消除定量分析過程中的基質(zhì)效應(yīng)，還可以對目標(biāo)化合物的定性檢出起到標(biāo)記作用，使各痕量成分在前處理步驟簡化、干擾嚴(yán)重的情況下，利用同位素的分子離子峰和特征碎片離子峰，以及標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時間進行定性分析。

以樣品中苯甲醛的鑒定為例，按1.3節(jié)的實驗條件對D5-苯甲醛和苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析，其保留時間分別為25.52 min和25.34 min，總離子流色譜圖示于圖1a、1b；在相同條件下對煙氣中性成分萃取液進行GC/MS分析，局部的總離子流圖示于圖1c。根據(jù)對照標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間可以初步確定圖1c中的峰1是苯甲醛+D5-苯甲醛，由于兩者結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相近，所以不能達到基線分離。目標(biāo)化合物苯甲醛與干擾成分不能完全分離，利用數(shù)據(jù)庫檢索時匹配度較低。在此情況下，從峰1中提取質(zhì)譜圖(保留時間為25.34 min)，示于圖2。圖2中包含了D5-苯甲醛和苯甲醛的分子離子峰和特征碎片峰，如D5-苯甲醛的分子離子峰(m/z111)以及特征離子峰m/z110、82、54和52等，這些離子中都包含了同位素原子；而苯甲醛相應(yīng)的離子峰分別是m/z106、105、77、51和50，其中，苯甲醛的裂解途徑示于圖3，由此可進一步確證峰1是苯甲醛+D5-苯甲醛。

注：a.D5-苯甲醛；b.苯甲醛；c.中性成分萃取液圖1 D5-苯甲醛(a)、苯甲醛(b)和局部(c)的總離子流色譜圖Fig.1 Partial total ion chromatogram of D5-benzaldehyde (a), benzaldehyde (b) and the neutral component extract (c)

圖2 圖1c中保留時間為25.34 min時提取的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum extracted at 25.34 min in Fig.1c

此外，通過計算可知峰1中保留時間為25.34 min的組分，比較質(zhì)譜圖中的特征碎片離子(m/z105、77、5、50)與分子離子(m/z106)的豐度比和苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的相同離子與分子離子的豐度比，相對誤差在歐盟EC/657標(biāo)準(zhǔn)允許范圍之內(nèi)，即峰1中保留時間為25.34 min的組分為苯甲醛。其他目標(biāo)化合物的定性分析過程與之相同。由此可知，盡管本研究省去了半制備HPLC分離步驟，但對于樣品基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)化合物定性分析干擾嚴(yán)重時，可以通過同位素的標(biāo)記作用，利用同位素標(biāo)記物相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和各碎片離子與分子離子的豐度比鑒定各目標(biāo)化合物。該方法簡便可靠，能有效排除同分異構(gòu)體等成分的干擾。

選擇帶有同位素原子的特征碎片離子作為各目標(biāo)化合物的定性離子，其中以信噪比高、干擾小的離子對作為定量離子。為使分析方法的選擇性和靈敏度均較高，每個化合物選擇2個定量離子，數(shù)據(jù)列于表1。在SIM模式下，選擇表1中的定量離子分別對10種化合物混標(biāo)溶液、相應(yīng)的10種同位素標(biāo)記物混標(biāo)溶液和中性成分萃取液進行GC/MS分析，其選擇離子流色譜圖(片段圖)示于圖4、圖5(圖中峰的編號與1.1節(jié)中化合物編號相同)。由圖5可知，通過選擇離子，萃取液中各目標(biāo)化合物與干擾成分達到基線分離，可進行準(zhǔn)確的定量分析。

圖3 苯甲醛分子的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathways of benzaldehyde molecule

圖4 10種化合物混標(biāo)溶液和相應(yīng)的10種同位素標(biāo)記物混標(biāo)溶液的選擇離子流片段圖Fig.4 Fragments of selected ion chromatogram of 10 compounds mixing standard solution and the respective 10 isotope markers mixing standard solution

圖5 加入10種同位素標(biāo)記物的中性成分萃取液的選擇離子流片段圖Fig.5 Fragments of selected ion chromatogram of the neutral components extract added 10 isotope markers

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

對1.2.1節(jié)配制的10種香味化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3節(jié)條件分析，以各化合物的峰面積與其相應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物的峰面積比為縱坐標(biāo)，化合物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以信噪比S/N=3和S/N=10計算方法的檢出限和定量限，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表2。

2.4 回收率實驗及與文獻方法的對比

本研究選擇的10種痕量中性香味成分在文獻[8]的測定中回收率均偏低，為了與之對比，選擇在相同品牌卷煙中添加一定量的各標(biāo)準(zhǔn)化合物，測定各自的樣品加標(biāo)回收率。在截留主流煙氣總粒相物的劍橋濾片上加入10種香味化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)量(用各化合物純度校正后的質(zhì)量)列于表3。按1.2.2節(jié)方法處理，然后按1.3節(jié)條件分析，平行測定5次，計算卷煙樣品中各目標(biāo)化合物加標(biāo)后的平均總含量。將不加標(biāo)樣品平行測定5 次，用表2中的線性方程計算原含量、平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果列于表3。

表2 10種化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 10 compounds

表3 回收率與精密度測定結(jié)果(n=5)Table 3 Results of recovery and precision (n=5)

由表3可以看出，所測卷煙煙氣中10種香味化合物的平均回收率在83.3%～106.6%之間，RSD在0.15%～8.69%之間，說明該方法準(zhǔn)確度和精密度較好。

本實驗與文獻[8]中該10種化合物的回收率測定方法均為樣品加標(biāo)回收率，具有可比性。由表3可以看出，本實驗測得的10種香味化合物的回收率與文獻[8]相比有較大提高。該結(jié)果表明，本實驗樣品前處理步驟簡單，可以有效降低痕量成分的含量損失；加入的同位素標(biāo)記物在提取效率、凈化過程中的損失、共存成分的影響等方面與被測物基本一致，能有效校正實驗中的基質(zhì)效應(yīng)，消除樣品在前處理步驟中含量損失帶來的影響，使測得的含量值更接近真實值，從而提高回收率。與文獻[8]相比，本實驗測得的10種香味化合物含量均有所提高，但含量的相對高低保持一致，如含量較高的成分均為香葉基丙酮和苯甲酸芐酯。

2.5 實際樣品的測定

用本方法對4種不同品牌成品卷煙(編號為1～4)和12種單料卷煙(編號為5～16)中10種中性香味成分的含量進行測定，結(jié)果列于表4。由表4可知，其中，香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4-二甲基苯乙酮和2-十一酮在成品卷煙中的含量均比在單料煙中高；苯甲醛、苯甲酸甲酯、異氟爾酮的含量在兩類卷煙中含量相差不大；乙酸糠酯、苯甲酸芐酯在成品卷煙中的含量均比在單料煙中低。本方法對各香味成分的含量測定更準(zhǔn)確，可以作為卷煙補香和加香的重要依據(jù)。

表4 16種卷煙樣品煙氣中10種香味化合物的含量Table 4 Contents of 10 aromatic components in smoke of 16 kinds of cigarette samples

3 結(jié)論

建立了同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析煙氣中10種痕量中性香味成分的方法。在前期研究的基礎(chǔ)上，簡化了樣品的前處理步驟，減少了樣品用量。通過對GC/MS分析條件的優(yōu)化和對各化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究，利用同位素標(biāo)記物的分子離子、特征碎片和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間等信息，使樣品中各目標(biāo)化合物在復(fù)雜基質(zhì)中得到準(zhǔn)確的定性分析；同時，同位素內(nèi)標(biāo)的加入有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了回收率。在SIM模式下對樣品進行GC/MS分析，待測目標(biāo)化合物與干擾成分得到完全分離，可滿足定量分析的要求。本研究所建立的定量分析方法對10種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 0，方法的檢出限為0.34～4.59 μg/kg，定量限為1.14～15.30 μg/kg，遠(yuǎn)低于各成分的含量，方法靈敏度較高。各化合物的平均回收率在83.3%～106.6%之間，RSD在0.15%～8.69%之間，可見該方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。在可獲得穩(wěn)定同位素的基礎(chǔ)上，利用該方法可以測定更多煙氣中痕量香味成分的含量，研究結(jié)果對卷煙主流煙氣中性香味成分含量的測定及指導(dǎo)卷煙加香加料具有重要意義。