MicroRNA-7-5p調(diào)控p53表達對非小細胞肺癌增殖及侵襲能力的影響

（云南省第二人民醫(yī)院 腫瘤科，云南 昆明 650021）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在肺癌中的比例約為85%，并且67%肺癌患者年齡≥65歲[1-2]。人類抑癌基因p53的失活能夠改變其對細胞生長、凋亡和DNA修復的調(diào)控作用，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗虿δ[瘤形成起重要作用[3-4]。在p53基因的調(diào)控作用中，microRNA-7-5p（miR-7-5p）能夠?qū)ζ淦鸬秸蜃饔肹5]。本研究以人NSCLC細胞株NCI-H1975作為研究對象，深入剖析miR-7-5p對NCI-H1975增殖、侵襲能力的干擾。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

肺癌細胞株NCI-H1975購自中國科學院細胞庫，胎牛血清購自美國Gibco公司，鏈霉素、青霉素及胰蛋白酶購自美國HyClone公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、細胞裂解液及MTS細胞增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，Trizol試劑、PCR引物和脂質(zhì)體Lipo fectamine? 2000購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司，p53抗體購自美國Santa Cruz公司，雙熒光素酶檢測報告系統(tǒng)試劑盒購自北京普洛麥格生物技術有限公司。miR-7-5p等引物序列由上海吉瑪公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

NCI-H1975培養(yǎng)于含1%鏈霉素、青霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM中，并置于5%二氧化碳CO2、37℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期，即融合度達80%左右時進行傳代培養(yǎng)，若未達到傳代密度，則每2天更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 熒光素酶活性檢測

按1×106個/孔將NCI-H1975細胞鋪板于6孔板中，培養(yǎng)24 h后均進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染中使用了2種螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒載體，分別是沒有表達作用的pMIR-report-3'UTR非突變體和具有表達作用的pMIR-report-3'UTRm突變體，兩者在實驗中被分別設置到不同的共轉(zhuǎn)染細胞作為對照。此外，質(zhì)粒采用的是具有表達海腎熒光素酶的pRL-TK質(zhì)粒。

NCI-H1975細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用細胞裂解液將細胞裂解，按照說明書提示，依次加入StopRlo和熒光素酶測試試劑Ⅱ，分別用于檢測海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性×100%。

1.4 p53 mRNA及蛋白檢測

按1×106個/孔將NCI-H1975細胞鋪板于6孔板中，培養(yǎng)24 h。依據(jù)對照原則，將轉(zhuǎn)染對象miR-7-5p與miR-NC分別作為miR-7-5p組和miR-NC組，未處理的細胞作為空白對照組。

qRT-PCR檢測p53 mRNA。NCI-H1975細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol試劑裂解各組細胞，提取總mRNA，參照東洋紡(上海)生物科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行qRTPCR擴增，反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性2 s，60℃延伸30 s，共40個循環(huán)。將單鏈的引物退火成雙鏈Oligos序列，連接入經(jīng)XhoⅠ和HpaⅠ限制性內(nèi)切酶對表達載體進行雙酶切得到線性化的RNA干擾載體。用2-ΔΔCt法將檢測的Ct值結果進行處理，比較各組變化[5]。

Western blotting檢測p53蛋白。第一步借助細胞裂解液提取轉(zhuǎn)染后的NCI-H1975細胞總蛋白；第二步使用BCA法對獲得的蛋白濃度進行測定；第三步通過10% SDS-PAGE對蛋白進行分離操作，樣本標準是30μg/孔。PVDE轉(zhuǎn)印蛋白，使用5%脫脂牛奶對其進行封閉操作。同時培育p53及相應的辣根過氧化物酶標記二抗，電化學發(fā)光免疫測定顯影。

1.5 細胞增殖能力檢測

將轉(zhuǎn)染miR-7-5p或miR-NC 48 h后的NCIH1975細胞及未處理的NCI-H1975細胞用胰蛋白酶消化、重懸，在96孔板中按照1 000個/孔的細胞密度接種，并于鋪板后的0、18、36、54和72 h觀測細胞增殖情況，檢測加入MTS試劑后上清液中450 nm波長處的光密度（optical density, OD）值。

1.6 細胞周期檢測

對各組細胞進行胰蛋白酶消化與重懸后，用70%冰乙醇進行固定處理24 h。用碘化丙啶對細胞進行染色，流式細胞儀檢測細胞周期情況，采用美國B&D公司的Version 3.4 CELL Quest軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理與分析。

1.7 細胞侵襲能力檢測

對NCI-H1975細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶進行細胞消化。在DMEM中加入0.2%胎牛血清，借助盼藍染色的方法檢測死細胞，間接測算出細胞存活率，其存活率≥95%。最后檢測細胞侵襲能力。依據(jù)Transwell小室法進行操作，在Transwell的上室接種各組細胞，均按照5×105個/孔的標準進行操作。與此同時，將DMEM注入到Transwell下室中，此時的DMEM中加入10%胎牛血清，在上、下室分別接種或注入材料后，進行24 h細胞常規(guī)培養(yǎng)。利用染色劑對已經(jīng)發(fā)生侵襲并穿透基質(zhì)膠的NCI-H1975細胞進行染色和脫色處理，測定560 nm波長處的OD值。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組遷移細胞數(shù)及克隆形成數(shù)比較

miR-7-5p對熒光酶表達發(fā)揮的抑制作用，是通過將3'UTR作為靶向調(diào)控位點實現(xiàn)的。各組的遷移細胞數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p組較miR-NC組低（P＜0.05）。各組克隆形成數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p組較miR-NC組低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組遷移細胞數(shù)、克隆形成數(shù)比較 （±s）

表1 各組遷移細胞數(shù)、克隆形成數(shù)比較 （±s）

空白對照組 198.000±2.231 83.000±3.211 miR-NC組 196.000±2.514 84.000±2.561 miR-7-5p 組 76.000±1.893 38.000±2.892 F值 201.142 267.232images/BZ_20_1281_423_2244_506.pngimages/BZ_20_1281_836_2244_919.png

2.2 miR-7-5p對p53的靶向作用

3'UTR位點因為受到miR-7-5p的靶向調(diào)控作用，抑制熒光素酶的翻譯表達，而miR-NC組沒有觀察到這種現(xiàn)象。miR-7-5p組與miR-NC組3'UTR相對熒光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當3'UTR調(diào)節(jié)位點發(fā)生突變，miR-7-5p組與miR-NC組3'UTRm相對熒光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），3'UTRm中的熒光素酶活性與是否加入miR-7-5p無關。見表2和圖1。

表2 兩組相對熒光素酶活性比較 （%，±s）

表2 兩組相對熒光素酶活性比較 （%，±s）

miR-NC組 100.000±10.125 100.000±8.672 miR-7-5p 組 71.500±9.421 100.000±10.231 t值 28.321 1.236images/BZ_20_1281_1781_2244_1864.pngimages/BZ_20_1281_2112_2244_2195.png

圖1 兩組相對熒光素酶活性比較 （±s）

2.3 各組p53 mRNA和蛋白相對表達量比較

各組p53 mRNA相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，miR-7-5p組較miR-NC組低（P＜0.05）。各組p53蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p組較 miR-NC 組低（P＜0.05）。見表3和圖2、3。

表3 各組p53 mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組p53 mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

空白對照組 0.981±0.013 1.000±0.021 miR-NC組 1.133±0.124 1.080±0.018 miR-7-5p 組 0.221±0.006 0.300±0.017 F值 15.852 14.961images/BZ_21_236_728_1199_811.pngimages/BZ_21_236_1141_1199_1224.png

圖2 各組NCI-H1975細胞中p53 mRNA相對表達量比較 （±s）

圖3 各組NCI-H1975細胞中p53蛋白的表達 （±s）

2.4 miR-7-5p對NCI-H1975細胞的增殖作用

空白對照組、miR-NC組和miR-7-5p組培養(yǎng)0、18、36、54及72 h細胞OD值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果如下：①不同時間點的細胞OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=18.571，P=0.001）；②各組細胞OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=73.231，P=0.001）；③各組OD值變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.752，P=0.001）。見表4。

2.5 各組NCI-H1975細胞周期比較

各組細胞周期的G0/G1期比例比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，miR-7-5p組高于空白對照組和miR-NC組（P＜0.05）。各組G2/M期比例比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p 組低于 miR-NC 組（P＜0.05）。各組S期比例比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-7-5p組低于空白對照組和miR-NC組（P＜0.05）。見表5。

表4 各組不同時間點NCI-H1975細胞OD值比較 （±s）

表4 各組不同時間點NCI-H1975細胞OD值比較 （±s）

組別 0 h 18 h 36 h 54 h 72 h空白對照組 0.311±0.012 0.454±0.011 0.583±0.007 0.614±0.006 0.835±0.003 miR-NC 組 0.312±0.013 0.455±0.012 0.584±0.011 0.668±0.011 0.801±0.007 miR-7-5p 組 0.312±0.011 0.356±0.009 0.382±0.010 0.423±0.009 0.596±0.011

表5 各組NCI-H1975細胞周期比較 （%，±s）

表5 各組NCI-H1975細胞周期比較 （%，±s）

組別 G0/G1 G2/M S空白對照組 56.2±3.7 11.3±4.2 31.6±3.6 miR-NC 組 55.1±2.3 13.2±2.9 32.7±4.1 miR-7-5p 組 67.8±3.5 12.7±3.6 19.2±2.5 F值 201.124 152.612 168.631 P值 0.003 0.003 0.001

2.6 各組NCI-H1975細胞的侵襲能力比較

空白對照組、miR-NC組和miR-7-5p組的侵襲細胞百分數(shù)分別為（99.312±12.452）%、（99.212±13.251）% 和（63.412±6.231）%， 經(jīng) 方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=16.327，P=0.002），miR-7-5p組低于空白對照組和miR-NC組（P＜0.05）；空白對照組與miR-NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組NCI-H1975細胞的侵襲能力比較 （±s）

3 討論

miRNA是一種內(nèi)源性的小分子，僅僅只有21～24個核苷酸。其在功能上不具備編碼功能，但是在細胞內(nèi)的翻譯階段卻可以通過靶向識別作用造成mRNA的沉默，甚至是降解。也就是miRNA可以在不完全堿基配對之后結合到mRNA的特異位點，造成翻譯階段被終止，降低功能蛋白的表達[6]。相關研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的眾多結合區(qū)域中，其3'UTR是miRNA最常見的結合位點區(qū)。miRNA對基因的調(diào)控作用相當普遍，在人體的眾多基因當中，高達92%的基因受其調(diào)控[7]。

目前有關生物信息學的研究也指出，在表達p53的眾多信使RNA堿基對當中，可能就潛藏著能與miR-7-5p相配對的靶向結合位點。另外，最近的科學研究也指明，在腦膠質(zhì)細胞瘤與胃癌細胞的p53蛋白被翻譯表達的過程中，miR-7-5p能夠通過靶向作用對其進行調(diào)控[8-9]，而這在本研究中得到了證實。首先，在實驗當中，3'UTR位點在突變之前受到miR-7-5p的靶向作用，但是當發(fā)生突變后，這種調(diào)控效應就不再存在了；另外NCI-H1975的miR-7-5p組的mRNA和蛋白都比miR-NC組要高，這可能就是因為p53蛋白的表達翻譯得到了miR-7-5p的正向調(diào)控。

在細胞增殖實驗檢測的結果當中，經(jīng)轉(zhuǎn)染的NCI-H1975細胞增殖能力表現(xiàn)出與miR-7-5p作用時間呈正相關，也就是說當作用時間延長，細胞增殖能力也會隨之提高。結合細胞周期的檢測結果，筆者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-7-5p的NCI-H1975細胞，因為S期被縮短而擁有了更短的細胞周期，這可能就是miR-7-5p組具有更強細胞增殖能力的內(nèi)因。另外，筆者在實驗當中也發(fā)現(xiàn)，在miR-7-5p對p53起到正向調(diào)控的時候，細胞的增殖水平卻表現(xiàn)出被削弱的現(xiàn)象。這可能是因為與增殖相關的蛋白在其表達過程中受到miR-7-5p的負面影響。有相關的體外實驗研究結果顯示，不管是胃癌細胞還是乳腺癌細胞都會因為p53的作用而被削弱了侵襲能力[10-11]。另外針對淋巴球性白血病的研究，也給出了相似的結果，當p53的表達受到miR-7-5p的靶向促進后，淋巴球性白血病的浸潤能力降低[12]。這在本研究當中也得到了間接的證實，轉(zhuǎn)染miR-7-5p的NCI-H1975細胞侵襲能力較miR-NC組弱。而惡性腫瘤的侵襲特征在其所有生物學特征中處于不容忽視的地位，患者往往因該侵襲過程導致病情惡化甚至是死亡[5]。所以這種能夠?qū)53起到正向靶向調(diào)控的miR-7-5p可能成為新的治療靶點。

綜上所述，本文通過在人NSCLC細胞NCI-H1975中轉(zhuǎn)染miR-7-5p發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p通過靶向下調(diào)p53的表達，從而抑制NCI-H1975細胞的增殖和侵襲能力，再次證明miR-7-5p在肺癌中發(fā)揮作用，為miR-7-5p作為NSCLC的生物診斷標志物和新的治療靶點提供更多的理論依據(jù)。