魯之中,李軍民,胡云芝,李曉輝,李衛(wèi),姜富國,李帥,劉學(xué)慶
(焦作市人民醫(yī)院 1.檢驗科,2.兒科,3.腫瘤外科,河南 焦作 454002;4.重慶醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,重慶 400016)
食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,對健康危害極大[1]。隨著醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的發(fā)展,食管癌發(fā)病機(jī)制及治療靶點的研究已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一組新發(fā)現(xiàn)的可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化的TGF超家族,其在腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2-3]。然而在食管癌細(xì)胞中TGF-β所發(fā)揮的作用及機(jī)制目前仍不完全清楚。本研究擬深入探討TGF-β在食管癌的功能及機(jī)制,為進(jìn)一步揭示食管癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
食管癌細(xì)胞系EC9706(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫),RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司),Lnc-ATB siRNA及對照(廣州銳博科技有限公司),Trizol裂解液(美國Sigma公司),TGF-β(深圳百恩維生物科技有限公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司),Transwell小室(德國Millipore公司)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10% Gibco胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系EC9706,溫度為37℃,二氧化碳CO2濃度為5%,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至70%左右的融合度后,將5μl Lnc-ATB-siRNA及Lnc-ATB對照經(jīng)250μl LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入EC9706細(xì)胞中,將轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞分為Lnc-ATB-siRNA組及Lnc-ATB-NC組。
1.2.2 Lnc-ATB表達(dá)水平檢測待食管癌細(xì)胞加入10 ng/ml TGF-β,將給予TGF-β處理的細(xì)胞作為TGF-β組,未給予TGF-β處理的細(xì)胞作為對照組。48 h后,收集兩組細(xì)胞,用Trizol裂解細(xì)胞,分別提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR)的反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性15 s,59℃退火35 s,共進(jìn)行39個循環(huán),實驗重復(fù)3次。Lnc-ATB正向引物 :5’-TCTGGCTGAGGCTGGTTGAC-3’,反向引物 :5’-ACACAGAATAAAATAACAC-3’;內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)正向引物:5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’,反向引物:5’-GAGGTCAATGAAGGGGTCATTG-3’。
1.2.3 EC9706細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測EC9706細(xì)胞不給予任何處理作為空白組;轉(zhuǎn)染Lnc-ATB-siRNA作為Lnc-ATB-siRNA組;給予10 ng/ml TGF-β處理并轉(zhuǎn)染Lnc-ATB-NC作為TGF-β+Lnc-ATB-NC組;給予10 ng/ml TGF-β處理并轉(zhuǎn)染Lnc-ATB-siRNA作為TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組。48 h后用胰酶消化各組細(xì)胞,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗2遍,用含10%牛胎血清蛋白的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/ml,取兩組細(xì)胞懸液各150μl,加入已預(yù)先用Matrigel包被基底膜的Transwell小室。下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600μl,培養(yǎng)48 h。而后取出小室,PBS沖洗2次,用棉簽小心擦去微孔膜內(nèi)層的細(xì)胞,95%乙醇固定兩組細(xì)胞5 min,用1%結(jié)晶紫溶液著色,PBS洗滌2次,倒置顯微鏡下分別計數(shù),每個樣本隨機(jī)計數(shù)10個視野。檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移步驟與細(xì)胞侵襲基本相同,區(qū)別在于細(xì)胞轉(zhuǎn)移Transwell小室預(yù)先不包被Matrigel基底膜。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗或方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
TGF-β處理食管癌EC9706細(xì)胞48 h后,分別提取TGF-β組和對照組細(xì)胞的總RNA,均逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用qRT-PCR檢測各組間Lnc-ATB的表達(dá),TGF-β組Lnc-ATB的相對表達(dá)量為(1.000±0.062),對照組為(0.417±0.084),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.431,P=0.007),TGF-β組較對照組高。而后應(yīng)用qRT-PCR檢測Lnc-ATB siRNA在EC9706細(xì)胞中的干涉效果,結(jié)果顯示Lnc-ATB-siRNA組EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB相對表達(dá)量為(0.438±0.073),Lnc-ATB-NC 組為(1.000±0.082),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.392,P=0.021),Lnc-ATB-siRNA組較Lnc-ATB-NC組低,Lnc-ATB siRNA可有效沉默EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)。見圖1。
圖1 各組EC9706細(xì)胞中Lnc-ATB的相對表達(dá)量比較 (±s)
TGF-β處理食管癌EC9706細(xì)胞48 h后,TGF-β組侵襲細(xì)胞數(shù)為(98.328±11.033)個,對照組為(64.238±7.431)個,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.542,P=0.032);TGF-β組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)為(45.759±15.561)個,對照組為(27.752±13.453)個,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.142,P=0.023),TGF-β組侵襲和轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)均高于對照組,提示TGF-β可促進(jìn)EC9706細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。見圖2、3。
圖2 TGF-β組與對照組TGF-β處理后EC9706細(xì)胞的侵襲能力比較 (×200)
圖3 TGF-β組與對照組TGF-β處理后EC9706細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力比較 (×200)
空白組侵襲細(xì)胞數(shù)為(48.492±11.325)個,Lnc-ATB-siRNA組 為(22.328±8.925) 個,TGF-β+Lnc-ATB-NC組為(74.284±14.925) 個,TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組為(37.827±5.329)個,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.324,P=0.014);空白組轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)為(39.728±9.645)個,Lnc-ATB-siRNA組為(19.658±7.371)個,TGF-β+Lnc-ATB-NC組 為(51.462±3.627) 個,TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組為(29.527±8.359)個,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.792,P=0.026)。TGF-β+Lnc-ATB-NC組細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力高于其他組(P<0.05);空白組細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力高于TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組 與 Lnc-ATB-siRNA組(P<0.05);TGF-β+Lnc-ATB-siRNA組與Lnc-ATB-siRNA組細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4~7。
圖4 各組TGF-β通過Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞侵襲能力 (×200)
圖5 各組TGF-β通過Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 (×200)
圖6 各組TGF-β通過Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞侵襲能力比較 (±s)
圖7 各組TGF-β通過Lnc-ATB上調(diào)EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力比較 (±s)
TGF-β作為生長因子對細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖起關(guān)鍵調(diào)控作用,在多種癌癥發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮重要作用[4]。既往有研究報道,TGF-β在食管癌中異常高表達(dá),其表達(dá)與食管癌的分期、分級密切相關(guān),腫瘤分化程度越低,TGF-β的表達(dá)越強(qiáng)[5]。更有研究顯示,食管癌中TGF-β下游效應(yīng)分子SMAD4表達(dá)水平降低,其表達(dá)與腫瘤的臨床病理分期及浸潤深度呈負(fù)相關(guān)[6]。本研究同樣顯示,給予TGF-β后,食管癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。由此可見,TGF-β在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有大量報道試圖闡明TGF-β在腫瘤中的作用機(jī)制,比如PASCHE[7]認(rèn)為TGF-β由基質(zhì)及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生后,在腫瘤微環(huán)境中可發(fā)揮腫瘤促進(jìn)因子的作用,通過刺激腫瘤新生血管的生成,發(fā)揮免疫抑制及合成細(xì)胞外基質(zhì)等作用,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。但這些研究并不能為TGF-β在食管癌中的作用提供更精確的分子機(jī)制。
TGF-β是一個被廣泛研究的細(xì)胞因子,惡性腫瘤會釋放大量TGF-β幫助癌細(xì)胞快速分裂,同時借助Treg抑制免疫細(xì)胞對癌細(xì)胞的殺傷力[8]。但是由于正常細(xì)胞不能缺少TGF-β,因此很難設(shè)計靶向的方法來治療癌癥??茖W(xué)家需要進(jìn)一步探索TGF-β的分子機(jī)制,從其上下游作用的關(guān)鍵分子著手,研究相應(yīng)的治療靶點,這也是本研究的目的所在。
長鏈非編碼RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄本,其>200個核苷酸,不具有蛋白編碼潛能。許多研究表明,LncRNA經(jīng)常在各種疾病中失調(diào),在廣泛的生物過程中有多種功能,如調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等[9-10]。有文獻(xiàn)報道,TGF-β可以激活部分長鏈非編碼RNA的表達(dá)及功能[11-12]。YUAN等[13]利用LncRNA芯片,結(jié)合經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)了1個介導(dǎo)TGF-β促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的LncRNA,并將這個新LncRNA命名為Lnc-ATB。有研究發(fā)現(xiàn),Lnc-ATB在肝細(xì)胞癌患者組織中表達(dá)水平異常升高,在肝細(xì)胞癌患者轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)則進(jìn)一步上調(diào),其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的侵襲特征呈正相關(guān),與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后亦呈正相關(guān)[14]。本研究主要探討TGF-β在食管癌中是否通過激活Lnc-ATB參與腫瘤的進(jìn)展,結(jié)果顯示給予TGF-β后,食管癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),同時Lnc-ATB的表達(dá)升高,而沉默食管癌細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá),給予TGF-β后,細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力并未增強(qiáng)。以上實驗結(jié)果說明在食管癌中TGF-β通過上調(diào)Lnc-ATB的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究為探索食管癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),為食管癌的治療提供了新的分子靶標(biāo)。