血紅素加氧酶1在兒童繼發(fā)性噬血細(xì)胞綜合征診斷及預(yù)后判斷中的價(jià)值研究

王穎超，李壯壯，朱桂英，殷楚云，王龍

噬血細(xì)胞綜合征（hemophagocytic syndrome，HPS），其特征是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞活化引起的吞噬細(xì)胞現(xiàn)象，導(dǎo)致全血細(xì)胞減少、發(fā)熱、肝脾大等臨床表現(xiàn)，病情嚴(yán)重且威脅患兒生命［1］，而臨床上缺乏診斷該病的特異性指標(biāo)。血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種由各種刺激產(chǎn)生的溶血酶，在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用［2］。HO-1主要分布于循環(huán)中的單核細(xì)胞及器官中的巨噬細(xì)胞（如肝臟枯否細(xì)胞、脾巨噬細(xì)胞），在多種應(yīng)激狀態(tài)下，才會(huì)誘導(dǎo)血清中HO-1的高表達(dá)。本研究分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR）檢測(cè)繼發(fā)性HPS、感染及健康兒童的血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平及在HPS發(fā)展過(guò)程中的變化，采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清HO-1、鐵蛋白的HPS臨床診斷價(jià)值，旨在探討血清HO-1水平在繼發(fā)性HPS患兒的作用及臨床診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年9月—2017年9月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科病房收治的86例繼發(fā)性HPS患兒（HPS組）及排除HPS診斷的66例感染患兒（感染組），以同期門診體檢的79例健康兒童為對(duì)照組。繼發(fā)性HPS診斷標(biāo)準(zhǔn)：滿足噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥（HLH）-2004診療指南診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］；排除原發(fā)性HPS、固有免疫缺陷病、惡性腫瘤、其他血液系統(tǒng)疾病及激素使用者。感染組包括膿毒癥、肺炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥等感染性疾病，且分別符合膿毒癥［4］、肺炎［5］、傳染性單核細(xì)胞增多癥［6］的診斷標(biāo)準(zhǔn)，感染組患兒均排除HPS診斷。本研究方案獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

本研究背景或創(chuàng)新點(diǎn)：

（1）噬血細(xì)胞綜合征（HPS）是可累及多個(gè)器官的巨噬細(xì)胞活化增殖性疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，且缺乏較為特異性的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，病情進(jìn)展迅速，易危及生命。血紅素加氧酶1（HO-1）是一種可被多種刺激誘導(dǎo)的血紅素降解酶，在單核/巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HPS患者的HO-1水平明顯高于風(fēng)濕性疾病、肝病、其他血液病、反復(fù)輸血患者和健康者，與血清鐵蛋白密切相關(guān)，具有很好的特異性。但未能進(jìn)一步判斷HO-1對(duì)HPS最佳診斷閾值。（2）本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HPS患兒HO-1表達(dá)水平明顯高于其他如肺炎、膿毒癥、傳染性單核細(xì)胞增多癥等感染性疾病患者；并得出對(duì)HPS最佳診斷閾值，分析與血清鐵蛋白的相關(guān)性，以及聯(lián)合檢測(cè)血清HO-1與鐵蛋白對(duì)疾病的診斷更具有特異性及參考價(jià)值。結(jié)論：HO-1不僅可能成為一種新的HPS診斷和監(jiān)測(cè)疾病活動(dòng)性的標(biāo)志物，而且影響患兒的預(yù)后。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集受試者性別、年齡、病因、實(shí)驗(yàn)室檢查〔白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、乳酸脫氫酶（LDH）、自然殺傷（NK）細(xì)胞百分比、鐵蛋白、纖維蛋白原（FIB）〕資料。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)血清HO-1水平 采集HPS組、感染組與對(duì)照組就診當(dāng)日空腹外周血3 ml及HPS組患兒治療前、治療后2周、4周、8周空腹外周血3 ml，以3 400 r/min 離心8 min，留取血清，-80 ℃冰箱保存。ELISA試劑盒由美國(guó)MN公司提供，酶標(biāo)儀由賽默飛世爾（上海）儀器有限公司提供，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 Real-time PCR檢 測(cè)HO-1 mRNA表 達(dá) 水 平 采集HPS組、感染組與對(duì)照組就診當(dāng)日空腹外周血3 ml，采用淋巴細(xì)胞分離液收集單核細(xì)胞，使用Trizol試劑盒提取總RNA，參照MMLV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明制備cDNA，HO-1 mRNA上游引物序列為：5'-CAGGCAGAGGGTGATAGAAGAGG-3'，下游引物序列為：5'-CTGGGAGCGGGTGTTGAGTG-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參對(duì)照，上游引物序列為：5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'，下游引物序列為：5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'。PCR反應(yīng)條件：95.0 ℃預(yù)變性1 min后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)（95.0 ℃ 變性15 s；55.0 ℃退火15 s；72.0 ℃延伸45 s）。瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算機(jī)對(duì)電泳條帶進(jìn)行掃描分析（Gel Works分 析），HO-1 mRNA相 對(duì) 表 達(dá) 量=（HO-1 mRNA吸光度/內(nèi)參GAPDH吸光度）×100。

1.3 HPS患兒治療方法 86例繼發(fā)性HPS患兒，部分因放棄或未進(jìn)行正規(guī)化療，52例患兒進(jìn)行正規(guī)化療。患兒按照HLH-2004指南［3］化療，包括初始治療和維持治療，總療程40周。

1.4 預(yù)后判斷 86例患兒從確診開(kāi)始隨訪，包括電話或門診隨訪，時(shí)間為1年。根據(jù)預(yù)后分為生存和死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)量資料不符合正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析；血清HO-1和鐵蛋白水平對(duì)HPS的診斷價(jià)值采用ROC曲線分析，計(jì)算靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、ROC曲線下面積（AUC），AUC比較采用Z檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 HPS組中，男47例，女39例；年齡7個(gè)月～14歲，中位年齡4.2歲；均無(wú)家族遺傳史；感染相關(guān)HPS（IAHS）55例〔IAHS中EB病毒感染相關(guān)HPS（EBV-HLH）28例〕，腫瘤相關(guān)HPS（MAHS）15例，風(fēng)濕免疫性疾病相關(guān)HPS（AAHS）9例，獲得性免疫缺陷病相關(guān)HPS 4例，病因不明3例。感染組中，男37例，女29例；年齡1～14歲，中位年齡4.5歲；肺炎42例，膿毒癥20例，傳染性單核細(xì)胞增多癥4例。對(duì)照組中，男48例，女31例；年齡1歲2個(gè)月～12歲，中位年齡6.6歲。HPS組患兒WBC、Hb、PLT、NK細(xì)胞百分比、FIB水平低于感染組，CRP、LDH、鐵蛋白水平高于感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

表1 HPS組與感染組患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較Table 1 Comparison of laboratory indices between HPS group and infection group

2.2 三組間血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較 對(duì)照組、感染組、HPS組血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中感染組、HPS組血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，HPS組血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平高于感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表2 三組間血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum HO-1 and HO-1 mRNA expression levels among the three groups

表2 三組間血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum HO-1 and HO-1 mRNA expression levels among the three groups

注：HO-1=血紅素加氧酶1；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與感染組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) HO-1（μg/L） HO-1 mRNA對(duì)照組 79 2.98±0.90 3.25±1.23感染組 66 11.32±3.46a 15.37±3.28a HPS組 86 31.44±7.20ab 29.78±6.92ab F值 322.612 268.128 P值 〈0.001 〈0.001

2.3 HPS患兒治療前后血清HO-1水平比較 HPS患兒治療前、治療后2周、4周、8周血清HO-1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中治療后2周、4周、8周血清HO-1水平低于治療前，治療后4周、8周血清HO-1水平低于治療后2周，治療后8周血清HO-1水平低于治療后4周，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

表3 HPS患兒治療前后血清HO-1水平比較（±s，μg/L，n=52）Table 3 Comparison of serum HO-1 level in children with HPS before and after treatment

表3 HPS患兒治療前后血清HO-1水平比較（±s，μg/L，n=52）Table 3 Comparison of serum HO-1 level in children with HPS before and after treatment

注：與治療前比較，aP＜0.05；與治療后2周比較，bP＜0.05；與治療后4周比較，cP＜0.05

時(shí)間 HO-1治療前 31.56±6.94治療后2周 18.13±4.23a治療后4周 11.37±2.42ab治療后8周 7.54±1.72abc F值 81.812 P值 〈0.001

2.4 HPS患兒血清HO-1水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 HPS患兒血清HO-1水平與WBC、Hb、PLT、LDH、NK細(xì)胞百分比、FIB均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系（rs=-0.153，P=0.334；rs=-0.213，P=0.172；rs=0.202，P=0.238；rs=0.146，P=0.355；rs=0.176，P=0.266；rs=0.092，P=0.532），與CRP、鐵 蛋 白 呈 正 相 關(guān)（rs=0.390，P=0.003；rs=0.661，P＜0.001）。

2.5 血清HO-1和鐵蛋白水平對(duì)HPS的診斷價(jià)值 血清HO-1水平選取最佳節(jié)點(diǎn)18.23 μg/L時(shí)，其診斷HPS的靈敏度為82.0%，特異度為99.1%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.9%，陰性預(yù)測(cè)值為84.6%，AUC=0.883；鐵蛋白水平選取最佳節(jié)點(diǎn)2 370 μg/L時(shí)，其診斷HPS的靈敏度為82.0%，特異度為72.0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為74.5%，陰性預(yù)測(cè)值為80.0%，AUC=0.830。血清HO-1聯(lián)合鐵蛋白診斷HPS的AUC=0.958。血清HO-1診斷HPS的AUC大于鐵蛋白，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.68，P=0.046）；血清HO-1聯(lián)合鐵蛋白診斷HPS的AUC大于血清HO-1和鐵蛋白，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.81，P=0.035；Z=1.98，P=0.023，見(jiàn)圖1）。

圖1 血清HO-1和鐵蛋白水平診斷HPS的ROC曲線Figure 1 ROC curves of serum HO-1，ferritin，and the combination of the two in the diagnosis of HPS

2.6 不同預(yù)后HPS患兒臨床資料比較 隨訪1年，86例HPS患兒中63例生存，23例死亡。生存與死亡HPS患兒性別、年齡、WBC、Hb、NK細(xì)胞百分比、FIB水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；生存與死亡HPS患兒病因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；死亡HPS患兒CRP、LDH、鐵蛋白、HO-1水平較生存HPS患兒升高，PLT較生存HPS患兒降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）。

表4 不同預(yù)后HPS患兒臨床資料比較Table 4 Comparison of clinical data of HPS patients with different outcomes

3 討論

HPS是一種危及生命的疾病，根據(jù)病因，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性HPS主要是由于損害淋巴細(xì)胞毒性的遺傳缺陷引起［7］。繼發(fā)性HPS常由感染、腫瘤、免疫性疾病、藥物、移植等因素引起，也可能與免疫缺陷有關(guān)，而最常見(jiàn)的病因是感染［8-9］。LI等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在HPS中，血清鐵蛋白水平升高比低纖維蛋白原血癥、高三酰甘油血癥和兩系血細(xì)胞減少癥更常見(jiàn)。高鐵蛋白血癥不僅存在于HPS中，也存在于其他風(fēng)濕性疾病、肝臟疾病和頻繁輸血的血液疾病中［11］，缺乏特異性。所以，發(fā)現(xiàn)診斷HPS更為特異性的指標(biāo)，對(duì)疾病的早期診斷、減少漏診及誤診率極其重要。

HO-1是一種誘導(dǎo)酶，能將血紅素降解為膽綠素、Fe2+和一氧化碳，在清除衰老和受損的紅細(xì)胞、全身鐵穩(wěn)態(tài)、紅細(xì)胞生成、血管止血、氧化和炎性應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［12］。MIYAZAKI等［13］研究發(fā)現(xiàn)，HPS患者血清中HO-1水平明顯高于其他血液病如白血病、淋巴瘤等。KIRINO等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在HPS和Still'S?。ˋSD）患者中，血清HO-1水平明顯高于其他風(fēng)濕性、肝臟及血液系統(tǒng)疾病。王宇等［14］發(fā)現(xiàn)血清HO-1水平在獲得性HPS患者中明顯升高，尤其在自身免疫性疾病相關(guān)性HPS患者中明顯高于淋巴瘤相關(guān)性HPS及IAHS。提示血清HO-1水平有可能成為診斷HPS的一個(gè)更為特異性的指標(biāo)。而國(guó)內(nèi)外對(duì)于HO-1在HPS中的研究多是關(guān)于成年人，關(guān)于兒童HO-1的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究顯示，HPS組患兒外周血HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于感染組和對(duì)照組，經(jīng)治療后HPS組患兒血清HO-1水平明顯下降，維持在一個(gè)較低的水平內(nèi)。與王宇等［14］研究相符。KIRINO等［11］研究也說(shuō)明，在HPS和成年ASD活躍的患者中，血清HO-1水平升高，HO-1水平與疾病活動(dòng)密切相關(guān)，而與臨床表型無(wú)關(guān)，而且在血清HO-1水平升高的HPS和ASD患者中，部分或者全部存在HO-1 mRNA過(guò)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清HO-1水平為18.23 μg/L，血清鐵蛋白為2 370 μg/L時(shí)，HPS可與感染明顯區(qū)分。血清鐵蛋白與HO-1診斷HPS的靈敏度均為82.0%，但血清鐵蛋白特異度為72.0%，血清HO-1特異度為99.1%。血清HO-1聯(lián)合鐵蛋白診斷HPS的AUC大于血清HO-1和鐵蛋白，說(shuō)明血清HO-1在診斷HPS方面具有很好的臨床價(jià)值，而且聯(lián)合檢測(cè)血清鐵蛋白與HO-1更具有診斷意義。與國(guó)外研究結(jié)果一致，高水平的血清鐵蛋白被廣泛用作HPS的標(biāo)志物［15］，但在診斷及預(yù)測(cè)預(yù)后方面并不特異，在肝損傷、多次輸血等情況下亦可有不同的表達(dá)水平［16］。而血清HO-1水平卻不受這些因素的影響，相比鐵蛋白，更具有特異性。

目前研究表明，HPS患者血清HO-1與鐵蛋白水平存在相關(guān)性，HO-1活性增加產(chǎn)生Fe2+，作為HO-1的亞鐵血紅素分解產(chǎn)物，是鐵蛋白合成的有力促進(jìn)劑，另外，由于Nrf2調(diào)控HO-1和鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子的激活可能參與了這兩種分子的同時(shí)過(guò)量產(chǎn)生，而且似乎HO-1、Nrf2或兩者共同均參與了肝臟疾病和頻繁輸血患者血清鐵蛋白水平升高［11］。這很好地解釋了血清HO-1和鐵蛋白具有高度相關(guān)性的原因。本研究顯示，HPS患兒血清HO-1水平與鐵蛋白呈正相關(guān)，而與WBC、Hb、PLT、LDH、NK細(xì)胞百分比、FIB均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系，更加驗(yàn)證了這一關(guān)系。而HPS患者循環(huán)HO-1的來(lái)源尚不確定，需要進(jìn)一步研究來(lái)確定血清HO-1水平升高的機(jī)制和來(lái)源。

本研究進(jìn)一步分析顯示，死亡HPS患兒CRP、LDH、鐵蛋白、HO-1水平較生存HPS患兒升高，PLT較生存HPS患兒降低。生存與死亡HPS患兒病因分布比較有差異，病因多以IAHS、MAHS為主，觀察上述指標(biāo)有助于判斷預(yù)后。

綜上所述，血清HO-1、HO-1 mRNA表達(dá)水平在繼發(fā)性HPS患兒中明顯升高，對(duì)HPS的診斷及預(yù)后判斷均具有明顯的參考價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)血清HO-1與鐵蛋白對(duì)診斷更具有特異性。不足之處是本研究為單中心觀察性的臨床研究，樣本量偏少，期待多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，進(jìn)一步確定HO-1和HO-1 mRNA在HPS診斷和治療方案制定中的意義。

作者貢獻(xiàn)：王穎超進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；李壯壯進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集；朱桂英進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；殷楚云進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；王龍進(jìn)行論文的修訂。

本文無(wú)利益沖突。