小麥-中間偃麥草藍(lán)粒代換系的創(chuàng)制與鑒定

葉曉斌，衛(wèi) 波，范仁春，張相岐

(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

小麥(TriticumL.)籽粒顏色一般為白色或紅色，但也有一些藍(lán)色、紫色等特殊粒色的品種和種質(zhì)資源。在一粒小麥(T.monococcumL.)、二粒小麥(T.aethiopicumJakubz.)和普通小麥(T.aestivumL.)中都有藍(lán)粒的報(bào)道[1-2]。小麥的藍(lán)色籽粒是因?yàn)樵诤蹖又杏兴{(lán)色花青素積累[3]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸⒖拱┖徒笛堑裙π4-5]。并且，藍(lán)粒小麥還含有較豐富的氨基酸和微量元素等對(duì)人體健康有利的成分，因而具有較高的營養(yǎng)保健價(jià)值[6-7]。在小麥遺傳育種中，藍(lán)色籽?？梢宰鳛闃?biāo)記性狀加以利用。李振聲等[8]通過普通小麥與十倍體長穗偃麥草遠(yuǎn)緣雜交方法培育了藍(lán)單體小麥。進(jìn)而，穆素梅等[9]利用藍(lán)單體培育出了穩(wěn)定遺傳的小麥缺體材料。利用藍(lán)粒標(biāo)記無需進(jìn)行大量的細(xì)胞學(xué)鑒定，只憑籽粒顏色就可以鑒別二體、單體或缺體材料。黃壽松等[10]利用小偃麥的藍(lán)粒性狀標(biāo)記選育了雄性不育-保持系，解決了小麥核型雄性不育系保持困難的問題。Hanson等[11]以藍(lán)粒為標(biāo)記性狀研究隔離距離對(duì)小麥品種間異交率的影響，確定了保證種子純度的最小隔離距離。

小麥的一些近緣屬種也有藍(lán)粒性狀，如偃麥草屬(Thinopyrum=Elytrigia)、山羊草屬(Aegilops)、黑麥屬(Secale)等。Jan等[12]將十倍體長穗偃麥草(Elytrigiapontica=Thinopyrumponticum=Agropyronelongatum)中控制藍(lán)粒性狀的染色體4Ag(=4E)導(dǎo)入普通小麥后，得到了4EL/4AS易位系，并將藍(lán)粒基因定位到4Ag染色體長臂上。后來，Zheng等[13]又將長穗偃麥草的藍(lán)?；駼a1定位到4Ag染色體長臂0.71～0.80區(qū)間，并開發(fā)了與藍(lán)?；蜻B鎖的分子標(biāo)記和FISH探針[14]。百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum=Elytrigiabessarabica)的藍(lán)?；虮幻麨锽aThb，并被定位于4Eb染色體長臂的著絲粒與FL0.52之間的區(qū)域[15]。Love 和Suneson[16]以及袁文業(yè)和孫善澄[2]曾報(bào)道在普通小麥與中間偃麥草(Et.intermedia)的雜交后代中也出現(xiàn)了藍(lán)粒材料，但未見進(jìn)一步研究。來自于栽培一粒小麥(T.monococcum，2n=2x=14, AA)的藍(lán)?；虮幻麨锽a2，并已被定位于4AL的著絲粒附近[17]。

為給藍(lán)粒小麥品種的選育提供新的種質(zhì)資源，并為中間偃麥草藍(lán)?；虻倪z傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，本研究利用八倍體小偃麥中5(來自普通小麥與中間偃麥草雜交)與普通小麥中國春的缺-四體系列材料雜交和回交，在后代中選育出兩份藍(lán)粒材料。通過細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記鑒定，確定了兩份藍(lán)粒小麥材料的染色體組成和控制藍(lán)粒性狀染色體的來源染色體組和同源群。

1 材料與方法

1.1 材 料

八倍體小偃麥中5(2n=8x=56，AABBDDXX)來自于普通小麥(2n =6x=42, AABBDD)與中間偃麥草(2n=6x=42, EeEeEeEeStSt或EeEeEbEbStSt)的雜交后代，由原黑龍江省農(nóng)科院孫善澄研究員培育[18]，種子由東北師范大學(xué)郝水院士惠贈(zèng)。一套普通小麥中國春(CS)的缺體-四體(NT)系列材料的種子由英國John Innes Centre的John Snape教授惠贈(zèng)。二倍體長穗偃麥草(2n=2x=14，EeEe)的種子由美國密蘇里大學(xué)的Perry Gustafson教授惠贈(zèng)。假鵝觀草[Pseudoroegneriastipifolia(Nevski) Love，2n=2x=14，StSt]的種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的李立會(huì)研究員惠贈(zèng)。中國春-二倍體長穗偃麥草[Et.elongata(Host) Nevski]的雙二倍體CS/THE(2n=8x=56, AABBDDEeEe)種子由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的王道文研究員惠贈(zèng)。百薩偃麥草[Et.bessarabica(Savul.and Rayss) Dubovik，2n=2x=14，EbEb(= JJ)]基因組DNA由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的韓方普研究員惠贈(zèng)。普通小麥中國春種子由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片

染色體制片參考Han等[19]的方法，略有 修改。

1.2.2 連續(xù)GISH-FISH分析

染色體的連續(xù)GISH-FISH鑒定參照Han等[19-20]的方法。GISH探針標(biāo)記體系為60 μL，包括要標(biāo)記的基因組DNA 6.0 μg，加重蒸水至 35.0 μL，10×Nick buffer 6.0 μL，dNTP (不含dUTP，1 mmol/L)5.0 μL，DNA polymerase I 10.0 μL，DNase 2.0 μL，F(xiàn)luorescein-12-dUTP(用于中間偃麥草基因組DNA標(biāo)記)或Texas Red-5-dCTP(用于二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草和假鵝觀草基因組DNA標(biāo)記)2.0 μL?；旌弦?5 ℃金屬浴標(biāo)記反應(yīng)2 h，然后加入480 μL ssDNA和1 mL(90%乙醇 + 10% NaAc)，混勻后-20 ℃過夜。12 000 r·min-1離心30 min，收集沉淀，用70%乙醇沖洗2次，晾干，加60.0 μL 2×SSC溶解并將探針-20 ℃避光保存。

GISH雜交液體系為10 μL，包括熒光標(biāo)記的偃麥草或假鵝觀草探針0.5 μL，封阻DNA (中國春基因組DNA，濃度為3.5 μg·μL-1) 4.5 μL， 2×SSC 5.0 μL。選取制備好的染色體制片，放入交聯(lián)儀中交聯(lián)兩次。將雜交液(每張染色體制片10 μL)滴加到染色體制片上的根尖酶解液區(qū)域，加塑料蓋玻片，放入墊有濕潤濾紙的容器內(nèi)，沸水浴5 min。將水浴過的染色體制片放入墊有濕潤濾紙的載玻片盒中(內(nèi)有載玻片支架)，55 ℃處理12 h后取出，2×SSC溶液洗脫蓋玻片。滴加10 μL DAPI復(fù)染液，蓋上24×50 mm蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察和照相。選取有較好有絲分裂中期相的染色體制片，用70%乙醇洗脫DAPI及熒光標(biāo)記后用于進(jìn)一步的FISH分析。

FISH檢測所使用的探針為來自于黑麥(SecalecerealeL.)的重復(fù)序列pSc119.2和來自于粗山羊草(AegilopstauschiiCoss.)的重復(fù)序列pAs1。探針pSc119.2用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記為綠色，探針pAs1 用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記為紅色。FISH探針標(biāo)記和雜交程序參考Han等[20]的方法。

1.2.3 SNP標(biāo)記分析

本研究所使用的SNP標(biāo)記為中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所的婁海娟博士[21]通過二倍體長穗偃麥草(Et.elongata) Ee基因組與普通小麥中國春直向同源基因之間的SNP位點(diǎn)對(duì)比開發(fā)的Ee基因組特異SNP標(biāo)記，共373對(duì)引物，分布在1E至7E染色體上。SNP標(biāo)記分析采用PCR擴(kuò)增方法。使用全式金公司的EASYTaq構(gòu)建20 μL PCR體系，包括模板DNA 1.0 μL(100 ng·μL-1)，正、反向引物各0.3 μL(0.1 μmol·L-1)，dNTP混合物1.6 μL(dNTPs 2.5 mmol·L-1)，Taq酶0.2 μL(EASYTaqDNA Polymerase 1.0 U)，10×EASYTaqbuffer (200 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1(NH4)2SO4)2.0 μL，LC Green熒光劑(Idaho) 1.0 μL，ddH2O 13.6 μL。程序?yàn)椋?94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。結(jié)果分析采用高分辨率熔解曲線(HRM)方法。高分辨率熔解曲線檢測儀器為Light Scanner(Idaho, LightScanner 96)。

1.2.4 SSR標(biāo)記分析

SSR標(biāo)記來自小麥。使用GenStar Mix構(gòu)建20 μL PCR體系。程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)粒小偃麥的選育

以八倍體小偃麥中5作母本，中國春缺-四體系列材料作父本進(jìn)行雜交獲得雜種F1，用缺-四體親本作母本回交一次后連續(xù)自交至BC1F4代。每代選取植株形態(tài)偏向中國春的類型混收并繁育下一代。結(jié)果分別在中5×N4BT4A和中5×N7BT7D兩個(gè)雜交組合的后代植株中發(fā)現(xiàn)了藍(lán)色籽粒(圖1)。分別收獲藍(lán)粒種子并自交繁殖一代。田間觀察顯示，藍(lán)粒株系與白粒姊妹系在株穗型上并無明顯差別。選取藍(lán)粒性狀不發(fā)生分離單株Zh5-a2-1(來自中5×N4BT4A組合)和Zh5-c13-2(來自中5×N7BT7D組合)的種子進(jìn)行染色體組成分析。

a：中國春；b：中國春缺-四體系N4BT4A；c：中國春缺-四體系N7BT7D；d：中5；e：藍(lán)粒株系Zh5-a2-1；f：藍(lán)粒株系Zh5-c13-2。

a:Chinese Spring; b:Chinese Spring NT line N4BT4A; c:Chinese Spring NT line N7BT7D; d:Zhong 5; e:Blue-grained line Zh5-a2-1; f:Blue-grained line Zh5-c13-2.

圖1 兩份藍(lán)粒小麥及其親本和中國春的種子

Fig.1 Seeds of the two blue-grained wheat lines and their parents and Chinese Spring

2.2 藍(lán)粒小偃麥的染色體組成

2.2.1 藍(lán)粒小偃麥的染色體組成

利用中間偃麥草基因組DNA作探針的GISH分析顯示，藍(lán)粒系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2的根尖細(xì)胞染色體數(shù)均為42條，包括40條小麥染色體和2條中間偃麥草染色體(圖2a, c)，即一對(duì)中間偃麥草的染色體代換了一對(duì)小麥的染色體。進(jìn)一步利用pSc119.2和pAs1作探針對(duì)同一染色體制片進(jìn)行FISH分析，通過與中國春標(biāo)準(zhǔn)核型[22]比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)藍(lán)粒系Zh5-a2-1和 Zh5-c13-2中被代換的一對(duì)小麥染色體分別為4B和4D(圖2b，d)。并且，兩個(gè)藍(lán)粒系中的一對(duì)中間偃麥草染色體有非常相似的形態(tài)大小和一致的FISH帶型，都在短臂靠近著絲粒區(qū)有一pAs1探針的雜交信號(hào)(圖2b和d中箭頭所示)。由此推斷，藍(lán)粒系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2分別是4B和4D染色體的二體代換系，并且二者可能代入了同一對(duì)中間偃麥草染色體。本研究也對(duì)兩個(gè)藍(lán)粒代換系的多個(gè)白粒姊妹系進(jìn)行了平行GISH鑒定，結(jié)果顯示在所有白粒姊妹系中均不存在中間偃麥草的染色體(圖2e, f)。由此說明，這兩個(gè)藍(lán)粒代換系的藍(lán)粒性狀是由代入的一對(duì)中間偃麥草染色體決定的。

2.2.2 藍(lán)粒代換系中中間偃麥草染色體的染色體組來源

由于尚沒有中間偃麥草的標(biāo)準(zhǔn)FISH核型可供參考，因此，僅根據(jù)FISH帶型尚不能判定藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中的中間偃麥草染色體的染色體組來源和同源群歸屬。研究表明，中間偃麥草的染色體組構(gòu)成可能為EeEeEeEeStSt[23]或EeEeEbEbStSt[24]，但中5中的中間偃麥草染色體的所屬染色體組還不清楚。為了明確藍(lán)粒代換系中的中間偃麥草染色體的染色體組來源，分別利用二倍體假鵝觀草(StSt)、二倍體長穗偃麥草(EeEe)和百薩偃麥草(EbEb)的基因組DNA作探針，用小麥基因組DNA做封阻，對(duì)代換系Zh5-a2-1進(jìn)行了GISH鑒定，同時(shí)以中間偃麥草基因組DNA為探針的GISH作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Zh5-a2-1中的一對(duì)中間偃麥草染色體只能與St基因組DNA探針雜交，而不能與Ee或Eb基因組DNA探針雜交(圖3)。當(dāng)用St基因組DNA探針雜交時(shí)，雜交信號(hào)分布于Zh5-a2-1的整條中間偃麥草染色體上，且信號(hào)強(qiáng)度與用中間偃麥草基因組DNA作探針的雜交信號(hào)相似(圖3a，b)。而當(dāng)用Ee或Eb基因組DNA探針雜交時(shí)，Zh5-a2-1中的一對(duì)中間偃麥草染色體則完全沒有雜交信號(hào)(圖3c，e)，但作為對(duì)照的同一細(xì)胞用中間偃麥草基因組DNA作探針雜交時(shí)，則都能產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號(hào)(圖3d，f)。由此推斷，藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1中的一對(duì)中間偃麥草染色體屬于St組。由于連續(xù)GISH-FISH分析結(jié)果顯示，另一個(gè)藍(lán)粒代換系Zh5-c13-2中的一對(duì)中間偃麥草染色體與Zh5-a2-1中的相同(圖2)，所以，可推定Zh5-c13-2中的一對(duì)中間偃麥草染色體也屬于St組。另外，用St基因組DNA作探針對(duì)中5的GISH分析結(jié)果顯示，在中5中有7對(duì)中間偃麥草染色體，其中兩對(duì)染色體在整條染色體上都有很強(qiáng)的St基因組DNA探針的原位雜交信號(hào)，推測其屬于St組。而另外5對(duì)染色體只有節(jié)段性的St組DNA探針雜交信號(hào)，推測其不屬于或不完全屬于St組染色體(結(jié)果未在本文中顯示)。由此說明中5中確實(shí)存在St組的染色體。

a：藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1染色體的GISH鑒定結(jié)果；b：與圖a同一細(xì)胞染色體的FISH鑒定結(jié)果；c：藍(lán)粒代換系Zh5-c13-2染色體的GISH鑒定結(jié)果；d：與圖c同一細(xì)胞染色體的FISH鑒定結(jié)果；e：藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1的白粒姊妹系Zh5-a2-2染色體的GISH鑒定結(jié)果；f：藍(lán)粒代換系Zh5-c13-2的白粒姊妹系Zh5-c13-3染色體的GISH鑒定結(jié)果。GISH探針為Fluorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組DNA；FISH探針分別為Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的pSc119.2 (綠色) 和Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的pAs1 (紅色)；箭頭示一對(duì)中間偃麥草染色體。

a:GISH identification of chromosomes in blue-grained substitution line Zh5-a2-1; b:FISH identification of the chromosomes in the same cell as subfigure a; c: GISH identification of chromosomes in blue-grained substitution line Zh5-c13-2; d:FISH identification of the chromosomes in the same cell as subfigure c. e:GISH identification of chromosomes in a white-grained sib line of blue-grained substitution line Zh5-a2-1; f: GISH identification of chromosomes in a white-grained sib line of blue-grained substitution line Zh5-c13-2.The Fluorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermediawas used as GISH probe; The Fuorescein-12-dUTP labelled repetitive sequence ofS.cerealepSc119.2(green) and Texas Red-5-dCTP labelled repetitive sequence ofAe.tauschiipAs1(red) were used as FISH probes; The arrows indicate the pair ofEt.intermediachromosomes.

圖2 小麥-中間偃麥草藍(lán)粒代換系染色體的連續(xù)GISH-FISH鑒定結(jié)果

Fig.2Identifications of chromosomes of common wheat-Et.intermedia blue-grained substitution lines by sequential GISH-FISH

2.2.3 藍(lán)粒代換系中的中間偃麥草染色體同源群歸屬

以上的細(xì)胞遺傳學(xué)分析已證明Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中被代換的小麥染色體同屬第四同源群，分別為4B和4D(圖2)，代入的中間偃麥草染色體屬于St組(圖3)，但其同源群歸屬仍不能確定。已有的研究表明，中間偃麥草和十倍體長穗偃麥草都有Ee和St染色體組，并且兩者有很近的親緣關(guān)系[25]。因此，本研究利用來自于二倍體長穗偃麥草Ee基因組的SNP標(biāo)記[21]，通過高分辨率溶解曲線(HRM)方法對(duì)藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中的中間偃麥草染色體同源群歸屬進(jìn)行了分析。經(jīng)過對(duì)373對(duì)SNP標(biāo)記引物的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有定位于4Ee染色體上的5對(duì)引物(2對(duì)定位于4EeS，3對(duì)定位于4EeL)對(duì)Zh5-a2-1和Zh5-c13-2擴(kuò)增產(chǎn)物的高分辨率溶解曲線與中國春明顯不同，而與中5和中國春-二倍體長穗偃麥草雙二倍體CS/THE相似(圖4，表1)。由此說明，藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2中的中間偃麥草染色體都與二倍體長穗偃麥草的4Ee染色體同源，應(yīng)為同屬第四同源群的4St。由此，將藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1和Zh5-c13-2分別命名為SubZh5-4St(4B)和SubZh5-4St(4D)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明來自中5的4St染色體上帶有控制藍(lán)粒性狀的基因。

2.2.4 藍(lán)粒代換系中的中間偃麥草染色體變異

藍(lán)粒代換系SubZh5-4St(4B)和SubZh5-4St(4D)的親本之一是八倍體小偃麥中5，即兩個(gè)代換系中的中間偃麥草染色體直接來自中5。因此，本研究對(duì)藍(lán)粒代換系和中5中的中間偃麥草染色體進(jìn)行了FISH比較分析。結(jié)果顯示，在中5中含有7對(duì)中間偃麥草的染色體，但并沒有與藍(lán)粒代換系中FISH帶型相同的(圖5a，圖2b，d)。比較發(fā)現(xiàn)，在中5中只有一對(duì)中間偃麥草的染色體(圖5a，箭頭所示的add3)在短臂近著絲點(diǎn)區(qū)有一個(gè)pAs1的雜交信號(hào)，長臂無信號(hào)，與代換系中的中間偃麥草染色體的信號(hào)位置及染色體形態(tài)都很相似，但在短臂末端還有一個(gè)很強(qiáng)的pSc119.2雜交信號(hào)。由此推測，藍(lán)粒代換系中的中間偃麥草染色體可能是由這對(duì)染色體演變而來的。為了證明這一推測，本研究對(duì)代換系SubZh5-4St(4D)的藍(lán)粒姊妹株進(jìn)行了大量鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)姊妹株Zh5-c13-1的染色體數(shù)也是2n=42，GISH鑒定也顯示有一對(duì)中間偃麥草的染色體，即也是一個(gè)二體代換系。但是，F(xiàn)ISH分析卻顯示Zh5-c13-1中的這對(duì)中間偃麥草染色體是異形的，其中一條與中5的add3染色體的FISH結(jié)果相同，即除了在短臂近著絲點(diǎn)區(qū)有一pAs1的紅色雜交信號(hào)外，在短臂末端也有一個(gè)很強(qiáng)的pSc119.2綠色雜交信號(hào)。而另一條則與其姊妹系SubZh5-4St(4D)中的FISH信號(hào)相同，即只在短臂近著絲點(diǎn)區(qū)有一pAs1的紅色雜交信號(hào)，在短臂端部沒有pSc119.2的綠色雜交信號(hào)(圖5b，箭頭所示)。由此推測，藍(lán)粒代換系中的一對(duì)中間偃麥草染色體在雜交選育過程中發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異，是由中5中的一對(duì)染色體(圖5a中的add3)發(fā)生短臂端部缺失后形成的。另外，在Zh5-c13-1中被代換的兩條小麥染色體也不是一對(duì)，而分別是一條4B和一條4D(圖5b)，即是一個(gè)雜合二體代換系。

a：藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1染色體用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的假鵝觀草基因組(St)DNA作探針(紅色)的GISH檢測結(jié)果；b：與圖a同一細(xì)胞用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組(EeEeSt或EeEbSt)DNA作探針(綠色)的GISH檢測結(jié)果；c：藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1染色體用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的二倍體長穗偃麥草基因組(Ee)DNA作探針的GISH檢測結(jié)果(無雜交信號(hào))；d：與圖c同一細(xì)胞用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組(EeEeSt或EeEbSt)DNA作探針(綠色)的GISH檢測結(jié)果；e：藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1染色體用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的百薩偃麥草基因組(Eb)DNA作探針的GISH檢測結(jié)果(無雜交信號(hào))；f：與圖e同一細(xì)胞用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的中間偃麥草基因組(EeEeSt或EeEbSt)DNA作探針(綠色)的GISH檢測結(jié)果。箭頭示一對(duì)中間偃麥草染 色體。

a:GISH identification of chromosomes in blue-grained substitution line Zh5-a2-1 using Texas Red-5-dCTP labelled genomic DNA ofPs.stipifolia(St) as probe (red). b. GISH identification of the same cell as subfigure a using Fuorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermedia(EeEeSt or EeEbSt)as probe (green); c: GISH identification of blue-grained substitution line Zh5-a2-1 using Texas Red-5-dCTP labelled genomic DNA of diploidEt.elongata(Ee)as probe (no hybridization signal); d:GISH identification of the same cell as subfigure c using Fuorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermedia(EeEeSt or EeEbSt)as probe (green);e. GISH identification of blue-grained substitution line Zh5-a2-1 using Texas Red-5-dCTP labelled genomic DNA of diploidEt.bessarabica(Eb) as probe (no hybridization signal); f. GISH identification of the same cell as subfigure e using Fuorescein-12-dUTP labelled genomic DNA ofEt.intermedia(EeEeSt or EeEbSt)as probe (green). The arrows indicate the pair ofEt.intermediachromosomes.

圖3 藍(lán)粒代換系Zh5-a2-1中中間偃麥草染色體的染色體組來源分析

Fig.3 Originated genome analysis ofEt.intermediachromosomes in blue-grained substitution line Zh5-a2-1

a：位于4EeS的SNP標(biāo)記4E05的熱熔解峰圖；b：位于4EeS的SNP標(biāo)記4E05的高分辨率熔解曲線；c：位于4EeL的SNP標(biāo)記4E16的熱熔解峰圖；d：位于4EeL的SNP標(biāo)記4E16的高分辨率熔解曲線圖。CS：普通小麥中國春；CS/THE：中國春與二倍體長穗偃麥草的雙二倍體。

a:The melting peaks of the SNP marker 4E05 from 4EeS; b: The melting curves of the SNP marker 4E05 from 4EeS; c:The melting peaks of the SNP marker 4E16 from 4EeL; d: The melting curves of the SNP marker 4E16 from 4EeL.CS:Common wheat Chinese Spring; CS/THE: Chinese Spring-diploidEt.elongataamphidiploid.

圖4 藍(lán)粒代換系的SNP標(biāo)記鑒定結(jié)果

Fig.4 Identification of blue-grained substitution lines by SNP markers

表1 檢測藍(lán)粒代換系的特異SNP標(biāo)記Table 1 Specific SNP markers for detection of blue-grained substitution lines

2.3 4St染色體特異SSR標(biāo)記的篩選

為了建立更便捷的跟蹤檢測藍(lán)粒代換系中中間偃麥草染色體(4St)的分子標(biāo)記方法，本研究分別以中國春和中5為對(duì)照，利用450對(duì)小麥的SSR標(biāo)記引物對(duì)代換系進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中存在兩個(gè)藍(lán)粒代換系與中5一致而與中國春不同的多態(tài)性片段(圖6)，它們都來自第四同源群，分別定位于小麥的4A和4B染色體上(表2)。這些SSR標(biāo)記可作為藍(lán)粒代換系的特異分子標(biāo)記跟蹤檢測4St染色體。

a：中5有絲分裂中期染色體的FISH分析，add1～add7表示7對(duì)中間偃麥草染色體，箭頭示一對(duì)add3染色體；b：代換系Zh5-c13-1有絲分裂中期染色體的 FISH分析，箭頭示一對(duì)異形中間偃麥草染色體(add3)。FISH探針分別為用Fuorescein-12-dUTP標(biāo)記的pSc119.2(綠色)和用Texas Red-5-dCTP標(biāo)記的pAs1(紅色)。

a:FISH analysis of mitotic metaphase chromosomes in Zhong 5，the add1-add7 mark seven pairs of chromosomes fromEt.intermedia，the arrows indicate a pair of add3 chromosomes; b:FISH analysis of mitotic metaphase chromosomes in substitution line Zh5-c13-1,the arrows indicate a pair of heteromorphicEt.intermediachromosomes (add3). The Fuorescein-12-dUTP labelled pSc119.2 (green) and Texas Red-5-dCTP labelled pAs1 (red) were used as FISH probes.

圖5 中5和藍(lán)粒代換系Zh5-c13-1染色體的FISH比較分析

Fig.5 FISH comparative analysis of chromosomes in Zhong 5 and blue-grained substitution line Zh5-c13-1

表2 檢測藍(lán)粒代換系的特異SSR標(biāo)記Table 2 Specific SSR markers for detecting blue-grained substitution lines

3 討 論

以往的研究表明，十倍體長穗偃麥草[13]、百薩偃麥草[15]和栽培一粒小麥[17]的藍(lán)粒基因都定位于第四同源群染色體，而本研究也證明藍(lán)粒代換系的藍(lán)粒性狀是由中間偃麥草的4St染色體控制的。由此看來，在小麥族植物中，決定籽粒藍(lán)色糊粉層的主效基因位點(diǎn)可能比較普遍地存在于第四同源群染色體上，它們很可能有共同的起源。

雖然長穗偃麥草的Ee染色體組與假鵝觀草的St染色體組有很近的親緣關(guān)系[25]，但基因組水平上的差異是可想而知的。本研究利用二倍體長穗偃麥草的SNP標(biāo)記成功地鑒定了藍(lán)粒代換系中來自中間偃麥草的4St染色體。在使用的373對(duì)SNP標(biāo)記引物中，有34對(duì)來自于4Ee連鎖群[21]，結(jié)果只有5對(duì)引物可用于鑒定4St代換系，有效率僅為14.7%。盡管有效率較低，但在St組分子標(biāo)記尚缺乏的情況下，作為一種替代辦法，用Ee組的SNP標(biāo)記鑒定St組染色體在一定程度上還是可行的。另外，SNP標(biāo)記雖然具有數(shù)量大、分布廣、分辨率高等許多SSR標(biāo)記無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求都相對(duì)較高，實(shí)驗(yàn)成本也較高。因此，為了建立鑒定藍(lán)粒代換系的簡便方法，本研究對(duì)小麥的SSR標(biāo)記進(jìn)行了篩選。結(jié)果獲得了4個(gè)可在小麥背景下特異性識(shí)別4St染色體的SSR標(biāo)記，它們可用于藍(lán)粒代換系的準(zhǔn)確鑒定。

中國春缺-四體的農(nóng)藝性狀并不好，本研究之所以選擇其作為創(chuàng)制代換系的親本，主要是參考了張學(xué)勇等[27]創(chuàng)制小麥異源代換系的缺體回交法，期望將與缺-四體中的缺體染色體部分同源的偃麥草染色體定向地導(dǎo)入到小麥背景中，以提高獲得部分同源染色體代換系的頻率。結(jié)果獲得的兩份代換系材料雖然都是部分同源染色體之間的代換，即4St分別代換了4B和4D，但其中的SubZh5-4St(4B)產(chǎn)生于中5 × N4BT4A組合，屬于定向代換，而SubZh5-4St(4D)則產(chǎn)生于中5×N7BT7D組合，屬于非定向代換。這個(gè)結(jié)果對(duì)于可代換的21對(duì)小麥染色體來說，較隨機(jī)代換具有明顯的定向代換傾向。但獲得的代換系材料還較少，缺-四體雜交/回交法誘導(dǎo)定向代換系的有效性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

a、b、c、d分別為SSR標(biāo)記gwm4、gwm251、gwm192和gwm495的擴(kuò)增結(jié)果。泳道M、1、2、3和4分別為 DNA marker、中國春、中5以及藍(lán)粒代換系SubZh5-4St(4B)和SubZh5-4St(4D)。箭頭示目標(biāo)條帶。

a, b, c and d represent the amplification profiles of SSR markers gwm4, gwm251, gwm192 and gwm495, respectively. The lanes M, 1, 2, 3 and 4 represent DNA marker, Chinese Spring, Zhong 5, SubZh5-4St(4B) and SubZh5-4St(4D),respectively.The arrows indicate the target bands.

圖6 藍(lán)粒代換系特異SSR標(biāo)記擴(kuò)增圖譜

Fig.6 Amplification profiles of blue-grained substitution lines with specific SSR markers

本研究獲得的兩份藍(lán)粒代換系的親本，八倍體小偃麥中5和中國春缺-四體都不是藍(lán)色籽粒，中5的原始親本中間偃麥草也不是藍(lán)色籽粒。同樣，產(chǎn)生藍(lán)粒后代最多的長穗偃麥草也不是藍(lán)粒，但卻產(chǎn)生了各種類型的藍(lán)粒后代[8,13]。已知小麥的藍(lán)粒性狀是由于在糊粉層中積累了大量的藍(lán)色花青素，但至今對(duì)藍(lán)色糊粉層的形成和調(diào)控機(jī)制尚屬未知。在植物中，天然存在的花青素有數(shù)百種，代謝途徑非常復(fù)雜。不同的基因型和不同的內(nèi)外環(huán)境都可產(chǎn)生不同的花青素組合，從而產(chǎn)生不同顏色的植物組織或器官。已知藍(lán)色小麥的糊粉層中主要有4種花青素[3]，但對(duì)其相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制還知之甚少。因此，非常有必要開展深入研究，以闡明藍(lán)色糊粉層形成的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為藍(lán)粒小麥的分子設(shè)計(jì)育種和特色食品或保健品的開發(fā)提供理論依據(jù)。