天山堇菜總黃酮抗菌、抗炎、解熱、鎮(zhèn)咳作用研究

王 雪 史玉柱 司麗君 趙麗娟 馬雪萍 黃 華

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊 830004

天山堇菜Viola thianschanica Maxim.是堇菜科（Violaceae）植物，藥用其全草，具有清熱解毒的作用[1]，臨床上主要用于感冒、發(fā)燒、頭痛、咽痛等，也可外用于疔瘡腫痛等癥。天山堇菜含揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、生物堿等成分，具有明顯的抗菌、抗氧化[2-4]等作用。本課題組已經(jīng)完成了天山堇菜總黃酮制備工藝，測(cè)得總黃酮含量為52%（文獻(xiàn)尚未發(fā)表）。本研究考察了天山堇菜總黃酮體內(nèi)、外抗菌、抗炎、解熱和鎮(zhèn)咳作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM 小鼠（體重18～22 g）、Wistar 大鼠（體重180～200 g）均購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)分別為SCXK（新）2016-0003、SCXK（新）2016-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究嚴(yán)格遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

天山堇菜總黃酮，總黃酮含量為52%，新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所植物化學(xué)室制備，批號(hào)：20 180116；復(fù)方一枝蒿顆粒，規(guī)格5 g/袋，即30 g/（人·d），新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號(hào)： 180358；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

SW-CT-IF 超凈化工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；YP 型電子天平（0.1 g），上海菁海儀器有限公司；YLS-8A 多功能誘咳引喘儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；SIM-SIR 獨(dú)立換氣系統(tǒng)籠具，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)菌種和培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌（批號(hào)：ATCC25923）、大腸埃希菌（批號(hào)：ATCC25922）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。M-H 瓊脂培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司，批號(hào)：20090305-00。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 天山堇菜總黃酮體外抗菌試驗(yàn) 培養(yǎng)基制作：M-H 瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)122℃高壓滅菌，分別分裝于無(wú)菌試管及無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每支試管0.9 mL，每個(gè)培養(yǎng)皿10 mL。參照文獻(xiàn)[5-8]采用試管稀釋法和平皿瓊脂稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。37℃培養(yǎng)24 h 后，肉眼觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。與藥液對(duì)照管比較，若加入細(xì)菌的藥液管仍澄清，則表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明該管藥物有抗菌作用；若渾濁，則表明細(xì)菌已生長(zhǎng)，該藥物無(wú)抗菌作用。以完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為細(xì)菌對(duì)該藥物的敏感度，即為該藥物的MIC。觀察藥物MIC 以上的無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的加藥管，分別吸取0.1 mL 培養(yǎng)物移種至平皿瓊脂培養(yǎng)基上，推開(kāi)藥液，37℃過(guò)夜，觀察計(jì)數(shù)平皿培養(yǎng)基中細(xì)菌菌落數(shù)，＜5 個(gè)菌落的藥物濃度為該藥物的MBC。

1.5.2 體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn) 確定菌液感染濃度：KM 小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：65000700000816。小鼠腹腔注射不同濃度的大腸埃希菌或金黃色葡萄球菌的菌懸液，0.5 mL/只，每個(gè)濃度組5 只小鼠，觀察記錄7 d內(nèi)小鼠的死亡情況，選擇能引起小鼠80%以上死亡的濃度為該菌液最佳感染濃度。正式實(shí)驗(yàn)：KM 小鼠100 只，雌雄各半。50 只用于觀察對(duì)大腸埃希菌感染小鼠的存活率，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：65000700000 898；50 只用于觀察對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：65000700000906。依體重、性別隨機(jī)均衡分為模型組、復(fù)方一枝蒿顆粒組（5.0 g/kg）和天山堇菜總黃酮0.08、0.16、0.32 g/kg 組，每組10 只。各組均按設(shè)定劑量灌胃給藥，模型組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉混懸液，連續(xù)3 d 給藥。末次給藥后1 h，各實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射能引起80%以上小鼠死亡的菌液，每只0.2 mL。參照文獻(xiàn)[5-6]的方法，記錄每組小鼠的死亡數(shù)，并計(jì)算死亡率。

1.5.3 天山堇菜總黃酮對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響KM 小鼠50 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：6500070000 0950。分組及給藥同“1.5.2”，給藥后1 h，參照文獻(xiàn)[5-12]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算腫脹度（左右耳片質(zhì)量之差）和腫脹抑制率。

1.5.4 天山堇菜總黃酮對(duì)冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響 KM 小鼠50 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：65000700000918。分組及給藥同“1.5.2”。參照文獻(xiàn)[5-9]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算藥物對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的抑制率。

1.5.5 天山堇菜總黃酮對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響 KM 小鼠50 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：6500070 0000958，分組及給藥同“1.5.2”。參照文獻(xiàn)[13-15]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察記錄小鼠的咳嗽潛伏期和2 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。

1.5.6 解熱作用 Wistar 大鼠40 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：65000200000861，體重180～200 g，將其隨機(jī)分為模型組、復(fù)方一枝蒿顆粒組（2.73 g/kg）和天山堇菜總黃酮0.07、0.14、0.28 g/kg 組，每組8 只。各給藥組均按設(shè)定劑量灌胃給藥，模型組給予0.5 % CMCNa，每天1 次，連續(xù)3 d。末次給藥前，依參照文獻(xiàn)[5]和文獻(xiàn)[16-22]的方法建立發(fā)熱模型，記錄造模后4、6、8、10 h 的體溫值，并計(jì)算其與基礎(chǔ)體溫的差值（△T）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)菌稀釋濃度見(jiàn)表1。天山堇菜總黃酮、復(fù)方一枝蒿對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC 值見(jiàn)表2。

表1 天山堇菜總黃酮體外抑菌實(shí)驗(yàn)菌濃度（×107 CFU/mL）

表2 天山堇菜總黃酮、復(fù)方一枝蒿對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的MIC、MBC 值（mg/mL）

2.2 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

天山堇菜總黃酮0.32 g/kg 可明顯降低大腸埃希菌感染小鼠模型和金黃色葡萄球菌感染小鼠模型的死亡率（P ＜0.05）。見(jiàn)表3～4。

表3 天山堇菜總黃酮對(duì)大腸埃希菌感染小鼠死亡率的影響

表4 天山堇菜總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠死亡率的影響

2.3 天山堇菜總黃酮對(duì)小鼠耳腫脹的影響

與模型組比較，天山堇菜總黃酮0.16、0.32 g/kg組耳腫脹程度明顯減輕（P ＜0.05 或P ＜0.01），耳腫脹抑制率分別為22.3%、31.6%。見(jiàn)表5。

2.4 天山堇菜總黃酮對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響

與模型組比較，復(fù)方一枝蒿顆粒組、天山堇菜總黃酮各劑量組均可顯著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高（P ＜0.05）。見(jiàn)表6。

表5 天山堇菜總黃酮對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

表6 天山堇菜總黃酮對(duì)冰醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響

2.5 天山堇菜總黃酮對(duì)氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響

與模型組比較，復(fù)方一枝蒿顆粒組和天山堇菜總黃酮各劑量組均可明顯減少氨水引起的小鼠咳嗽反應(yīng)次數(shù)（P ＜0.05 或P ＜0.01），天山堇菜總黃酮0.16、0.32 g/kg 組可顯著延長(zhǎng)咳嗽潛伏期（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)表7。

表7 天山堇菜總黃酮對(duì)氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響（）

表7 天山堇菜總黃酮對(duì)氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響（）

注：與模型組比較，**P ＜0.01，*P ＜0.05。“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

2.6 天山堇菜總黃酮對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響

與模型組比較，天山堇菜總黃酮0.14 g/kg 組在給予干酵母造模后6～8 h 降溫效果明顯（P ＜0.05），天山堇菜總黃酮0.28 g/kg 組在造模后6 h 具有顯著降溫作用（P ＜0.05）。見(jiàn)表8。

3 討論

本研究測(cè)得天山堇菜總黃酮對(duì)大腸埃希菌的MIC 和MBC 分別為0.49、0.98 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 和MBC 分別為1.95、3.90 mg/mL，說(shuō)明其具有明顯的抗菌作用，同等實(shí)驗(yàn)條件下，其抗菌作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥復(fù)方一枝蒿。小鼠耳腫脹模型和腹腔毛細(xì)血管通透性增高模型都是常規(guī)篩選抗炎藥物的模型，通過(guò)這兩個(gè)模型，本研究發(fā)現(xiàn)天山堇菜總黃酮0.16、0.32 g/kg 劑量均具有明顯的抗炎作用。在大鼠發(fā)熱模型中，本研究發(fā)現(xiàn)天山堇菜總黃酮0.14 g/kg 在造模后6、8 h 具有明顯的解熱作用，0.28 g/kg 在造模后6 h 也具有較好的解熱作用。在氨水引咳實(shí)驗(yàn)中，天山堇菜總黃酮三個(gè)劑量組均具有明顯的鎮(zhèn)咳作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天山堇菜總黃酮提取物具有較好的抗菌、解熱、鎮(zhèn)咳、抗炎作用，并且其體內(nèi)外抗菌作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥復(fù)方一枝蒿顆粒。

表8 天山堇菜總黃酮對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響（）

表8 天山堇菜總黃酮對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱反應(yīng)的影響（）

注：與模型組比較，*P ＜0.05?！?”表示無(wú)數(shù)據(jù)

復(fù)方一枝蒿可解表祛風(fēng)，涼血解毒，廣泛應(yīng)用于邪毒所致的感冒發(fā)燒、咽喉腫痛、病毒性感冒等[23]。天山堇菜作為特色民族藥材具有療效確切、安全有效的特點(diǎn)。復(fù)方天山堇菜顆粒、復(fù)方比那甫西丸、降熱比那甫西糖漿在新疆民間被廣泛應(yīng)用來(lái)治療感冒等呼吸道傳染病，以上經(jīng)典名方的君藥均為天山堇菜。但天山堇菜抗流感方面的研究卻鮮有報(bào)道，基于民間臨床用藥經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]，本研究前期發(fā)現(xiàn)天山堇菜總黃酮提取物具有較好的抗甲型流感病毒活性，在防治流感方面具有廣闊的應(yīng)用前景[24]。本研究通過(guò)對(duì)經(jīng)典的炎癥、咳嗽和解熱模型的復(fù)制，以具有廣泛應(yīng)用基礎(chǔ)的抗流感藥物復(fù)方一枝蒿顆粒為陽(yáng)性對(duì)照藥，發(fā)現(xiàn)天山堇菜總黃酮不僅具有抑制炎癥的作用，還可有效緩解感染引起的發(fā)熱、咳嗽等癥狀，此外，還具有較好的抗菌作用。本研究為天山堇菜在防治流感方面的應(yīng)用提供了充分的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，為進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)為抗流感病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。