人參皂苷Rb1 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對膿毒癥小鼠重要臟器的保護作用

黃 敏 陶星宇 賈寶輝 楊少龍 徐春鳳

1.南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江西南昌 330000；2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西南昌 330003；3.河南省天然藥物提取和醫(yī)療技術(shù)應(yīng)用工程中心，河南鄭州 451460；4.鄭州市重癥感染、創(chuàng)傷與修復(fù)重點實驗室，河南鄭州 450007；5.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室，河南鄭州 450052

膿毒癥（Sepsis）是指感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，可產(chǎn)生危及生命的器官功能損害。目前其臨床機制還不十分清楚，臨床上多認為是由細菌感染激發(fā)的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的相互作用進而造成全身各系統(tǒng)、器官的損傷[1]。心臟和肺作為機體重要的器官，在膿毒癥受累的臟器中比較常見。近些年已有相關(guān)研究認為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膿毒癥造成的重要器官損傷的發(fā)生中具有重要作用[2]。姚詠明等[3]提出在膿毒癥的發(fā)病過程中，各種刺激均可影響細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能狀態(tài)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激本身能參與機體各器官功能的損傷，其反應(yīng)狀態(tài)對調(diào)控膿毒癥病理進程具有重要影響。膿毒癥可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的激活又參與膿毒癥組織器官的壞死[4]。伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標記性蛋白，而凋亡蛋白caspase-12 通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，兩者都能作為具有特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的相關(guān)蛋白。

本研究通過檢測膿毒癥小鼠重要器官GRP78 及caspase-12 的表達，觀察人參皂苷對膿毒癥小鼠是否具有保護作用以及探討其可能的保護機制是否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過表達來實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雌性小鼠60 只（4～6 周齡C57BL/6，飼養(yǎng)條件為：溫度18～22℃，濕度50%～60%。購于三峽大學(xué)，許可證號：SYXK（鄂）2017-0012），體重25～30g。所有實驗動物對待和照顧嚴格遵循《實驗動物管理條例》[5]，并經(jīng)過鄭州大學(xué)實驗審批。按照隨機數(shù)字表法分為正常組、假盲腸結(jié)扎并穿孔（CLP）組、人參皂苷組、CLP組，每組15 只。

1.2 主要試劑及儀器

注射用人參皂苷Rb1（50 mg/支，批號：110704-201827，上海源葉生物科技有限公司），30%丙烯酰胺（批號：680853295，北京索萊寶生物科技有限公司），小鼠單抗β-actin（批號：ah01032107，武漢博士德生物工程有限公司），兔多抗grp78（70～78 kD）（批號：00019435，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），兔多抗caspase-12（45 kD）（批號：gr143401-9，Abcam）；電子天平（精度0.01 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），水平搖床（TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽（北京六一儀器廠），病理切片機（德國Leica RM 2016 輪轉(zhuǎn)式切片機），奧林巴斯BX53 型生物顯微鏡，載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.3 小鼠膿毒癥模型制備

建立膿毒癥小鼠模型[6]。動物術(shù)前禁食12 h，腹腔注射質(zhì)量分數(shù)為7%的水合氯醛350 mg/kg 麻醉，于左下腹作長1～1.5 cm 切口，游離腸系膜和盲腸，在距盲腸盲端2/3 長度處環(huán)行結(jié)扎，在距盲端1 cm 處貫通穿刺，擠出糞便少許，回納腸系膜和盲腸入腹腔。逐層縫合關(guān)腹，其中假CLP 組只進行開腹關(guān)腹處理，術(shù)后不注射人參皂苷，正常組不做任何處理。模型制備成功后立即向小鼠人參皂苷組腹腔注射20 mg/kg 的人參皂苷Rb1 溶液，而CLP 組和假CLP 組則注射等體積的生理鹽水，之后每間隔8 h 追加腹腔注入。術(shù)后小鼠自由進食飲水，24 h 后取材。

1.4 一般狀況和大體形態(tài)學(xué)

動物造模術(shù)后24 h 內(nèi)觀察動物有無萎靡、寒顫、豎毛、腹瀉、膿性尿及眼角分泌物增加，以及其呼吸、大小便、飲食和活動情況。

1.5 病理學(xué)檢測

動物造模術(shù)后24 h 處死動物，將取得的小鼠心肌及肺組織浸入10%甲醛溶液中固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察，分析各組病理改變。

1.6 蛋白測定

將每組取得的6 只小鼠的心肌及肺組織保存。Western blot 檢測GRP78、caspase-12 蛋白表達：組織塊置于EP 管中勻漿及裂解，將裂解液移至離心管中，4℃下12 000 r/min 離心5 min（離心半徑7.5 cm），取上清液-20℃保存。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）適當(dāng)稀釋蛋白，避光孵育30 min 后電泳，轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的封閉液（TBST）浸泡PVDF 膜，搖床封閉2 h，再將PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF 膜。稀釋二抗，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，搖床孵育2 h。將ECL 試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1 比例混勻，滴加工作液于PVDF 膜上，熒光帶明顯后吸去多余底物液，覆上保鮮膜，X 光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗晾干，掃描膠片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及大體觀

與正常組比較，CLP 組小鼠活動減少，嗜睡，精神明顯萎靡，食欲減退，體重減輕，膿尿。瀕死前寒顫、呼吸窘迫。解剖可見CLP 組小鼠腹腔混濁，膿性滲出液較多，伴惡臭；盲腸腫脹發(fā)黑、壞疽和粘連；心臟等重要臟器顏色暗紅，表面可見出血斑點。人參皂苷組小鼠上述改變均較CLP 組明顯減輕，解剖人參皂苷組小鼠腹腔未見明顯膿性滲出，無惡臭，盲腸輕度腫脹，無粘連，心臟等重要臟器顏色表面未見明顯出血斑點。與CLP 組比較，假CLP 組小鼠各方面情況與人參皂苷組大致相同或更輕。

2.2 病理學(xué)改變

肺組織：CLP 組可見肺間質(zhì)及肺泡毛細血管明顯擴張，充血水腫，肺泡間隔增寬，部分區(qū)域肺萎縮，肺泡腔大量炎癥細胞浸潤；人參皂苷組肺泡組織結(jié)構(gòu)相對清晰、完整，炎癥細胞浸潤減輕，肺泡大小均勻；正常組及假CLP 組病理下組織清晰可見，未見明顯異常。

心肌組織：CLP 組心肌橫紋模糊，波浪樣變、細胞核壞死嗜酸性變，炎癥細胞浸潤；人參皂苷組炎癥細胞浸潤較少，心肌橫紋可見，壞死細胞少；假CLP 組和正常組心肌纖維均排列整齊，未見異常。見圖1。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子蛋白表達

圖1 4 組小鼠肺組織、心肌組織病理下改變（HE 染色，200×）

與假CLP 組比較，CLP 組心肌及肺組織GRP78、caspase-12 蛋白表達水平在術(shù)后均顯著上調(diào)，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與CLP 組比較，人參皂苷組心肌及肺組織GRP78、caspase-12 蛋白表達水平均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與假CLP 組比較，人參皂苷組蛋白表達水平略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表1。

圖2 人參皂苷Rb1 對心肌、肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78、caspase-12 蛋白表達

表1 心肌、肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的測定（）

表1 心肌、肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的測定（）

注：與假CLP 組比較，*P＜0.01；與CLP 組比較，#P＜0.05。GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

3 討論

本實驗結(jié)果表明，給予人參皂苷Rb1 能夠減輕膿毒癥小鼠心肌和肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78 及caspase-12 蛋白表達，減輕膿毒癥小鼠的感染程度及重要器官損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由于未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的失衡。持久或者強烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會引發(fā)程序性細胞死亡或凋亡[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是膿毒癥的重要病理機制，有助于成為病情診斷及治療的合適靶點[8]。Ferlito 等[9]發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膿毒癥發(fā)病過程起主要的負面作用，并提出臨床干預(yù)的新靶標以及治療的潛在策略。GRP78 是啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子之一[10-11]。下調(diào)GRP78 能夠明顯減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激，改善膿毒癥細胞損傷[12]。caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上特有的一種caspase 蛋白，只在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞凋亡中出現(xiàn)，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的小鼠凋亡途徑中發(fā)揮核心作用[13]。本研究觀察到，CLP 組小鼠心肌及肺組織中檢測到的GRP78 和caspase-12 蛋白濃度均能較假CLP 組及正常組明顯升高。

膿毒癥被定義為感染伴器官功能障礙，尋找改善和治療膿毒癥的藥物仍是當(dāng)前的任務(wù)所在[14]。中醫(yī)認為，膿毒癥屬于外感病癥中危重癥候，“瘀血、熱毒”是膿毒癥的主要發(fā)病機制，治療以“清熱涼血，解毒，活血行瘀通絡(luò)”為原則，在西醫(yī)常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用中藥治療可有效抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，抑制膿毒癥患者過度免疫應(yīng)答[15]。人參皂苷是人參的主要成分，其藥用價值已得到廣泛肯定，已應(yīng)用于多種疾病的治療和預(yù)防[16-17]。人參皂苷Rb1 作為人參提取得到的一種活性物質(zhì)，具有多種藥理活性，提取及分離也相對簡單，是目前的研究熱點[18]。

研究指出，人參皂苷可以減輕炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激，增加一氧化氮合成，從而減輕內(nèi)皮細胞的損傷[19]。曹暢等[20]指出人參皂苷Rb1 可以通過抗氧化、抗凋亡、抑制鈣超載等機制在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用，能減少炎性因子的釋放，抑制白細胞趨化及黏附，降低血管內(nèi)皮損傷，促進血管新生等。馮其麟等[21]在實驗中發(fā)現(xiàn)給重癥感染小鼠盡早注射人參皂苷Rb1 可以降低小鼠體內(nèi)的炎性反應(yīng)水平，其機制可能是通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常蛋白表達，緩解細胞凋亡啟動進程而實現(xiàn)。臧安緣等[22]在構(gòu)建大鼠心肌缺血模型實驗中證實人參皂苷Rb1 可改善心肌缺血大鼠細胞損傷，通過減少線粒體釋放凋亡因子，清除氧自由基，抑制心肌細胞的凋亡及自噬通路的傳導(dǎo)，從而抗心肌缺血保護心肌。Zhao 等[23]在發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1作為人參的生物活性成分，能夠誘導(dǎo)下調(diào)Bax/Bcl-2比值和caspase-3表達水平來預(yù)防大鼠脊髓缺血再灌注損傷。

4 小結(jié)

總之，人參皂苷Rb1 因其相對簡單的提取過程，并且在人參、三七、西洋參等植物中占有較大比例等優(yōu)勢，近年來越來越受到重視。人參皂苷Rb1 能夠?qū)δ摱景Y小鼠起到一定的保護作用，可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度表達而發(fā)揮作用，但膿毒癥發(fā)病復(fù)雜，機制尚未完全闡明，并且人參皂苷Rb1 是否存在其他途徑減輕炎性反應(yīng)還有待證實，關(guān)于人參皂苷Rb1 對膿毒癥的具體保護機制還需進一步研究。