基于高通量測(cè)序技術(shù)研究老年人腸道菌群結(jié)構(gòu)變化*

余 莉 李 紅 王思平

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院健康管理研究院國(guó)賓二科(100853)

背景：隨著我國(guó)人口的老齡化，老年人的健康保健備受關(guān)注。目的：探討增齡對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)提升老年人健康水平。方法：收集30例健康老年人(60～80歲)和10例健康青年人(18～40歲)的糞便樣本，采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定所有糞便細(xì)菌的16S rRNA基因V3、V4區(qū)序列，使用MiSeq 16S宏基因組APP和Qimme軟件分析菌群物種分類、物種多樣性指數(shù)、樣本組間顯著性差異和各組生物學(xué)標(biāo)志物。結(jié)果：老年健康組與青年健康組腸道菌群OTU均數(shù)接近，物種多樣性相似(P>0.05)。Metastats分析顯示，在菌門水平上，兩組間優(yōu)勢(shì)菌門擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在菌屬水平上，兩組間共有20余種菌屬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。老年健康組八疊球菌屬(Sarcina)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Olsenella、Rheinheimera、Terrisporobacter、食酸菌屬(Acidovorax)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae_UCG-003)、糞芽孢菌屬(Coprobacillus)、Gelria、Aquabacterium、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、Caldicoprobacter、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、Turicibacter豐度顯著增高，青年健康組厭氧乙酸屬(Acetanaerobacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae_UCG-009)、草酸桿菌屬(Oxalobacter)、糞球菌屬_2(Coprococcus_2)豐度顯著增高。LEfSe分析顯示，老年健康組生物學(xué)標(biāo)志物富集于食酸菌屬、纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacterium_nodatum_group)、梭菌科_1(Clostridiaceae_1)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)，青年健康組則富集于普氏菌屬_2(Prevotella_2)、羅氏菌屬(Roseburia)、厭氧乙酸屬。結(jié)論：隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生一定程度的改變。老年人產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌明顯減少，同時(shí)機(jī)會(huì)致病菌增多。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，被譽(yù)為人類“第二基因組”的腸道菌群成為研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的改變與代謝性疾病、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、精神疾病、神經(jīng)退行性疾病、消化道腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展之間存在關(guān)聯(lián)。影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的因素主要有性別、年齡、宿主遺傳背景、環(huán)境、食物、抗菌藥物等[1]。我國(guó)是世界上60歲以上老年人最多的國(guó)家[2]，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局年度調(diào)查(2011)和《中國(guó)老齡事業(yè)發(fā)展報(bào)告(2013)》，我國(guó)已全面進(jìn)入人口老齡化社會(huì)，老年人的健康保健和醫(yī)療成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，預(yù)防衰老相關(guān)疾病，改善老年人健康是亟待解決的社會(huì)問(wèn)題。本研究主要探討增齡對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)為提升老年人健康水平提供新思路。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

連續(xù)收集2016年1月—2018年1月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院健康管理研究院進(jìn)行健康體檢、檢查項(xiàng)目包括常規(guī)結(jié)腸鏡檢查的個(gè)體。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～40歲或60～80歲；②結(jié)腸鏡檢查結(jié)果提示未見(jiàn)異常；③體力狀況ECOG評(píng)分0～2，依從性良好；④簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤和放化療患者；②近1個(gè)月服用過(guò)微生態(tài)制劑(益生菌、益生元、合生元)、深海魚(yú)油制劑(omega-3)、抗氧化劑(維生素A、C、E)；③肝腎功能異常和胰腺疾病；④自身免疫性疾病，近3個(gè)月服用過(guò)非甾體消炎藥、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素；⑤嚴(yán)重心腦血管疾病、糖尿病、高脂血癥；⑥肥胖(體質(zhì)指數(shù)>28 kg/m2)；⑦活動(dòng)性炎癥性腸病、結(jié)直腸息肉；⑧近1個(gè)月內(nèi)感染、使用抗菌藥物；⑨近1個(gè)月服用過(guò)聚乙二醇等導(dǎo)瀉劑；⑩慢性便秘、急慢性腹瀉。入組患者根據(jù)年齡分為老年健康組(60～80歲)和青年健康組(18～40歲)。

二、方法

受檢者于結(jié)腸鏡檢查前留取糞便標(biāo)本，通過(guò)篩選納入研究者以高通量測(cè)序技術(shù)(FloraCheckTM，蘇州艾達(dá)康醫(yī)療科技有限公司)測(cè)定所有糞便細(xì)菌的16S rRNA基因V3、V4高可變區(qū)序列，使用MiSeq 16S宏基因組APP和Qimme軟件分析菌群物種分類、物種多樣性指數(shù)、樣本組間顯著性差異和各組生物學(xué)標(biāo)志物，獲得老年健康組與青年健康組腸道菌群組成及其活性信息。

1. OTU(operational taxonomic units, 運(yùn)算分類單元)分析和物種注釋：OTU是一個(gè)人為設(shè)置的分類單元，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將相似性>97%者歸為一個(gè)OTU。以韋恩圖表示兩組特有或共有的OTU個(gè)數(shù)。將總OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)物種在不同分類水平上進(jìn)行注釋，以profiling柱狀圖表示兩組物種的相對(duì)豐度。

2. α多樣性分析：基于OTU分析結(jié)果，可反映菌群豐度和多樣性，包括chao1、observed-species、PD-whole-tree和shannon四個(gè)指數(shù)，其中chao1常用于評(píng)估物種總數(shù)，shannon用于估算樣本微生物多樣性，本研究應(yīng)用這兩個(gè)指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3. β多樣性分析：用于比較樣本在物種多樣性方面的差異。本研究采用主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)比較樣本間菌群組成的差異，以二維坐標(biāo)圖呈現(xiàn)。坐標(biāo)圖上兩點(diǎn)距離越近，樣本組成越相似；兩點(diǎn)距離越遠(yuǎn)，樣本組成相似度越低。

4. 差異性分析：采用Metastats檢驗(yàn)對(duì)物種組成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組別從菌門、菌屬水平進(jìn)行菌群分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5. LEfSe分析：LEfSe采用線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)估算每組物種豐度對(duì)差異效果影響的大小，找出顯著差異性的群落或物種，即宏基因組生物學(xué)標(biāo)志物(biomarker)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

共40例健康成人納入研究，其中老年健康組30例，青年健康組10例。老年健康組男性15例，女性15例，平均年齡(67.0±4.6)歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)(22.72±1.69) kg/m2；青年健康組男性6例，女性4例，平均年齡(31.7±5.9)歲，BMI(22.44±2.14) kg/m2。兩組間性別(χ2=0.033,P=0.855)和BMI(t=0.429,P=0.670)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.519,P=0.001)。

二、生物信息學(xué)分析

1. OTU和豐度分析：老年健康組OTU個(gè)數(shù)為4 791條，青年健康組為3 472條(圖1)。根據(jù)物種注釋結(jié)果，各樣本物種在不同分類等級(jí)中組成柱狀圖，可見(jiàn)各樣本豐度較高的物種及其比例(圖2)。

2. α多樣性分析：chao1、shannon指數(shù)分析圖中，老年健康組與青年健康組OTU均數(shù)接近，兩組物種多樣性相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

3. β多樣性分析：在屬水平上對(duì)老年健康組和青年健康組進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果顯示主成分1和2無(wú)法將兩組有效區(qū)分，主成分1可解釋兩組差異的8.6%，主成分2可解釋兩組差異的6.51%(圖4)。

4. 老年健康組和青年健康組注釋、主成分分布：將總OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)物種在不同分類水平上進(jìn)行注釋，作物種profiling柱狀圖，縱坐標(biāo)表示相對(duì)豐度，不同顏色對(duì)應(yīng)不同物種名稱，色塊長(zhǎng)度表示該物種的相對(duì)豐度比例。此步驟主要在門、屬水平進(jìn)行分析。

①門水平：兩組樣本共包含14個(gè)門，所有樣本的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。老年健康組豐度最高的4個(gè)門依次為：擬桿菌門53.8%，厚壁菌門34.0%，變形菌門9.1%，放線菌門(Actinobacteria) 2.0%；而青年健康組分別為：擬桿菌門63.1%，厚壁菌門32.0%，變形菌門3.4%，放線菌門0.7%(圖5)。Metastats分析顯示兩組間四個(gè)菌門差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 老年健康組(A)和青年健康組(B)基于OTU的韋恩圖

圖2 老年健康組(A)和青年健康組(B)各樣本在屬水平上的物種相對(duì)豐度

②屬水平：老年健康組優(yōu)勢(shì)菌屬大都屬于擬桿菌門，菌屬豐度依次為：擬桿菌屬(Bacteroides)34.9%，普氏菌屬_9(Prevotella_9)11.3%，糞桿菌屬(Faecalibacterium)4.5%，埃希菌屬(Escherichia-Shigella)1.7%，薩特菌屬(Sutterella)1.7%，Alistipes1.5%；青年健康組優(yōu)勢(shì)菌屬同樣大都屬于擬桿菌門，菌屬豐度依次為：擬桿菌屬32.6%，普氏菌屬_9 19.1%，糞桿菌屬4.4%，普氏菌屬_2 3.8%，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)1.7%，Parasutterella1.7%，Alistipes1.4%(圖6)。Metastats分析顯示，在菌屬水平上，兩組間共有20余種菌屬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。老年健康組八疊球菌屬(Sarcina)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、Olsenella、Rheinheimera、Terrisporobacter、食酸菌屬(Acidovorax)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae_UCG-003)、糞芽孢菌屬(Coprobacillus)、Gelria、Aqua-bacterium、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、Caldico-probacter、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、Turicibacter豐度顯著增高，青年健康組厭氧乙酸屬(Acetanaero-bacterium)、漫游球菌屬(Vagococcus)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae_UCG-009)、草酸桿菌屬(Oxalo-bacter)、糞球菌屬_2(Coprococcus_2)豐度顯著增高。

圖3 老年健康組(A)和青年健康組(B)α多樣性分析

圖4 老年健康組(A)和青年健康組(B)β多樣性分析

圖5 老年健康組(A)和青年健康組(B)樣本菌群在門水平上的主成分

5. LEfSe分析：以LEfSe分析尋找有顯著差異性的菌屬，即宏基因組生物學(xué)標(biāo)志物，結(jié)果顯示老年健康組生物學(xué)標(biāo)志物富集于食酸菌屬、厚壁菌門的纏結(jié)優(yōu)桿菌(Eubacterium_nodatum_group)和梭菌科_1(Clostridiaceae_1)、變形桿菌門的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)；青年健康組生物學(xué)標(biāo)志物富集于普氏菌屬_2、羅氏菌屬(Roseburia)、 厭氧乙酸屬(圖7)。

討 論

2010年和2011年，Biagi等[3]和Claesson等[4]分別發(fā)表了關(guān)于意大利和愛(ài)爾蘭老年人腸道菌群的研究，是衰老腸道菌群研究領(lǐng)域中兩個(gè)標(biāo)志性、引領(lǐng)性的研究。人體腸道菌群直至2～3歲才近似成人并趨于穩(wěn)定。影響腸道菌群的因素包括遺傳、種族、年齡、生活和飲食習(xí)慣、環(huán)境等，其中宿主遺傳背景對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)率僅為1.9%，環(huán)境因素在腸道菌群的形成過(guò)程中起決定性作用[5]。老年人飲食結(jié)構(gòu)的改變以及腸道蠕動(dòng)功能下降，導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，腸黏膜通透性增加，腸道微生態(tài)發(fā)生一定程度的變化。研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性低度炎癥是老齡和各種年齡相關(guān)疾病最一致的生物學(xué)特征之一[6]。最近證據(jù)表明，腸道菌群可能在老齡相關(guān)炎癥中起關(guān)鍵作用[7]。

圖6 老年健康組(A)和青年健康組(B)樣本菌群在屬水平上的主成分分布

本研究α多樣性分析顯示，老年健康組和青年健康組的OTU均數(shù)接近，兩組物種多樣性相似；β多樣性分析顯示，兩組物種主要成分組成接近。在物種分類水平上，擬桿菌門和厚壁菌門是腸道菌群的主要組成成分，本研究中兩組均為擬桿菌門占比最高，厚壁菌門/擬桿菌門比值在老年健康組和青年健康組分別為0.63和0.51，組間擬桿菌門和厚壁菌門豐度均無(wú)明顯差異。上述結(jié)果與既往對(duì)老年腸道菌群的研究結(jié)果有所不同。Odamaki等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群豐度和多樣性隨年齡增長(zhǎng)而降低，老年人群擬桿菌門和變形菌門豐度隨年齡增長(zhǎng)而增加，厚壁菌門豐度則隨年齡增長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)。而B(niǎo)ian等[9]對(duì)中國(guó)健康人群的橫斷面研究顯示，老年健康人群的腸道總體微生物組成與青年健康人群相似，差異主要存在于與<20歲的人群比較時(shí)。各研究結(jié)果不同的原因可能在于：①不同國(guó)家、地區(qū)的研究對(duì)象，在種族、生活和飲食習(xí)慣等方面存在差異。②研究采用的測(cè)序方法不同。分子生物學(xué)技術(shù)常用的測(cè)序方法包括高通量測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和PCR-梯度凝膠電泳，不同方法各有其優(yōu)勢(shì)和局限性。③對(duì)老年人的定義不同，導(dǎo)致不同研究檢測(cè)人群中老年人的平均年齡存在較大差異。

本研究Metastats分析顯示，在菌屬水平，產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌在老年健康組與青年健康組間豐度差異較大，已鑒定出的產(chǎn)生丁酸鹽細(xì)菌瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和糞球菌屬[10]在青年健康組中明顯增多。丁酸鹽作為一種短鏈脂肪酸(SCFAs)，是結(jié)腸細(xì)胞的能量來(lái)源之一，并可通過(guò)細(xì)胞代謝、菌群穩(wěn)態(tài)、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)以及基因/表觀遺傳調(diào)控等機(jī)制發(fā)揮抗炎和抗腫瘤作用。對(duì)丁酸的機(jī)制研究表明其可促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞凋亡；通過(guò)抑制組蛋白脫乙?；刚{(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)腸道屏障的完整性，降低腸道通透性；通過(guò)cAMP依賴性機(jī)制激活糖異生作用，從而有益于機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)[11-12]。青年健康組草酸桿菌屬豐度亦較高，其具有促進(jìn)體內(nèi)草酸排泄的作用，可調(diào)節(jié)宿主草酸穩(wěn)態(tài)、預(yù)防草酸鈣腎結(jié)石形成以及其他草酸相關(guān)病理改變[13]。何方等的團(tuán)隊(duì)分析了中國(guó)西南地區(qū)148例健康中老年人的腸道菌群，鑒定出的與年齡呈負(fù)相關(guān)的菌屬中包括草酸桿菌屬，同時(shí)發(fā)現(xiàn)衰老相關(guān)特定菌群與免疫老化之間可能存在關(guān)聯(lián)[14]。老年健康組糞芽孢菌屬和腸桿菌屬數(shù)量明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)糞芽孢菌屬在慢性功能性便秘患者和結(jié)腸癌模型大鼠腸道中的豐度顯著增高，提示其可能為潛在致病菌[15-16]；而腸桿菌科在腸易激綜合征(IBS)患者腸道中的豐度較對(duì)照組顯著增高[17]。芽孢桿菌屬、腸桿菌屬等參與了腸道內(nèi)未消化蛋白的發(fā)酵，此種細(xì)菌腐敗過(guò)程可能破壞腸道穩(wěn)態(tài)，氨、腐胺等腐敗產(chǎn)物參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生[18]。此外，老年健康組柔膜菌門的厭氧支原體屬、紅蝽菌科豐度顯著增高。在高脂飲食大鼠中，柔膜菌門被證明與肥胖相關(guān)代謝參數(shù)有關(guān)[19]。有研究[20]發(fā)現(xiàn)病態(tài)肥胖個(gè)體腸道菌群中紅蝽菌科豐度增高，但在胃旁路術(shù)后可恢復(fù)至正常體質(zhì)量個(gè)體水平，提示該物種可能具有致代謝紊亂作用。予小鼠飲食中長(zhǎng)期添加左旋肉堿，可見(jiàn)盲腸菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，厭氧支原體屬數(shù)量增多并與參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的三甲胺-N-氧化物合成增加有關(guān)[21]。上述發(fā)現(xiàn)提示了年齡對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響，老年人腸道中機(jī)會(huì)致病菌增多。然而本研究未發(fā)現(xiàn)既往研究公認(rèn)的具有促進(jìn)健康作用的雙歧桿菌數(shù)量在老年健康組與青年健康組間存在顯著差異，與部分作者的研究發(fā)現(xiàn)相一致[22]。分析其原因可能與不同研究的受檢者來(lái)自不同地域、腸道菌群背景不同等因素有關(guān)。此外，產(chǎn)丁酸鹽糞桿菌屬以及與人體健康和代謝相關(guān)的Akkermansia在本研究老年健康組與青年健康組間亦無(wú)明顯差異，進(jìn)一步提示了腸道菌群與宿主間關(guān)系的復(fù)雜性，特定微生物的作用應(yīng)在具體腸道菌群背景之上進(jìn)行分析。

本研究通過(guò)LEfSe分析發(fā)現(xiàn)老年健康組食酸菌屬、厚壁菌門的纏結(jié)優(yōu)桿菌和梭菌科、變形桿菌門的叢毛單胞菌科富集。纏結(jié)優(yōu)桿菌多見(jiàn)于口腔疾病患者[23]。近年對(duì)口腔菌群的研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分口腔細(xì)菌可轉(zhuǎn)移并定植于結(jié)腸，尤其是機(jī)會(huì)致病菌，結(jié)直腸癌患者腸道富集菌種中有數(shù)個(gè)來(lái)源于口腔[24]。本研究中老年健康組纏結(jié)優(yōu)桿菌富集在腸道衰老中的作用有待進(jìn)一步明確。梭菌科是腸道正常優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，既包括有益菌也包括有害菌，有益梭菌主要有擬球梭菌亞群(Clostridiumcoccoidesgroup)和柔嫩梭菌亞群(Clostridiumleptumgroup)兩大亞群，而有害梭菌則以艱難梭菌(Clostridiumdifficile)為代表。本研究老年健康組梭菌科富集，具有差異性的糞芽孢菌屬數(shù)量增多，具有潛在致病可能。食酸菌屬對(duì)人體腸道功能以及健康和疾病的影響有待進(jìn)一步研究。青年健康組產(chǎn)丁酸鹽羅氏菌屬富集，研究[25]證明產(chǎn)丁酸鹽羅氏菌屬數(shù)量減少是潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道微生態(tài)失衡的特征之一。一項(xiàng)百歲老人腸道宏基因組學(xué)研究[26]顯示，與衰老相關(guān)的腸道微生物組特征為產(chǎn)SCFAs相關(guān)基因缺失、糖類分解能力下降和蛋白水解功能增強(qiáng)。在較年輕的老年人隊(duì)列中，同樣發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)SCFAs功能降低[27]。上述發(fā)現(xiàn)表明青年人可能擁有更健康的腸道微生態(tài)。

綜上所述，本研究主要探討了老年人群與青年人群腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，部分差異性菌群的代謝功能及其對(duì)宿主影響的作用機(jī)制尚需開(kāi)展更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生一定程度的改變，表現(xiàn)為老年人產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌明顯減少，同時(shí)機(jī)會(huì)致病菌增多。調(diào)節(jié)和維持腸道微生物健康無(wú)疑是一種值得關(guān)注和探索的醫(yī)療策略，是促進(jìn)老年人身體健康、改善其生活質(zhì)量，進(jìn)而緩解醫(yī)療壓力的研究方向。我國(guó)目前尚無(wú)大規(guī)模衰老人群的腸道菌群研究，本研究對(duì)年齡與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化的初步探索可為今后衰老腸道微生態(tài)的深入研究提供線索和參考。