高良姜油-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的抗氧化活性及抑制亞硝胺合成作用

鐘賽意，劉壽春，陳建平，蘇偉明，諶素華，劉 海，秦小明

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省亞熱帶果蔬加工現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088）

高良姜（Alpinia oきcinarum Hance）又名徐聞良姜，別名小良姜，為姜科植物的干燥根莖，是一種熱帶、亞熱帶多年生山姜屬植物，是常見(jiàn)的調(diào)味品和食用香料，廣泛分布于廣東、海南和廣西等地區(qū)，其中廣東湛江徐聞縣是其原產(chǎn)地。高良姜已被國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)列為“藥食兩用”的農(nóng)產(chǎn)品之一[1]，具有較高的藥用和食用價(jià)值。前人研究表明其具有溫胃、止嘔、散寒止痛的功效[2]，以及促進(jìn)滲透性、抗?jié)?、抗炎、抗缺氧等藥理作用[3]。高良姜油為高良姜主要的有效成分之一，但其難溶于水，見(jiàn)光、遇熱易分解，且具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，同時(shí)其性甘辣，直接服用刺激性較大，這也是許多植物精油存在的共性問(wèn)題；如果能克服這些問(wèn)題，將高良姜油進(jìn)一步制成咀嚼片、沖劑、飲料等，將大大拓寬其用途[4]。羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是β-CD的羥丙基衍生物，具有親水表面與疏水內(nèi)腔，能更顯著增大難溶性物質(zhì)的溶解度，其水溶性較β-CD大大提高，溶血性也更低，具有更高的安全性，為低毒、安全、有效的藥物增溶劑。目前，尚鮮有采用HP-β-CD制備高良姜油包合物并對(duì)其活性影響進(jìn)行研究的報(bào)道。因此，本研究擬采用HP-β-CD包合高良姜油，并采用顯微鏡、薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、紫外（ultraviolet，UV）光譜等儀器對(duì)包合物的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其抗氧化活性和抗亞硝胺合成作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為高良姜油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高良姜油由廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室自制。新鮮高良姜采自廣東湛江徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)高良姜原產(chǎn)基地，將根莖洗凈干燥，粉碎后過(guò)80 目篩備用，采用超臨界二氧化碳萃取得到淡黃色、澄清透明的高良姜油，以棕色小玻璃瓶避光常溫保存。

HP-β-CD（食品級(jí)） 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）、胃蛋白酶（生化試劑）、小牛胸腺DNA 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%綿羊紅細(xì)胞（red blood cell，RBC） 鄭州百基生物科技有限公司；鄰苯三酚、雙氧水、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、抗壞血酸、鐵氰化鉀、硫酸銅、亞硝酸鈉、氯化鈉、碳酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、α-萘胺、二甲胺和香草醛 中國(guó)國(guó)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW120電子天平 日本SHIMADZU公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FD8508型冷凍干燥機(jī) 韓國(guó)iLShinBioBase公司；5810R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；HSB-Ш循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；UV-5100 UV-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；TU-1901雙光束UV-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TENSOR27型FT-IR儀 德國(guó)Bruker公司；XD-101倒置顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司；BPCL型超微弱化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x 中國(guó)科學(xué)院生物物理所。

1.3 方法

1.3.1 高良姜油-HP-β-CD包合物制備方法的篩選

1.3.1.1 飽和水溶液法

參考文獻(xiàn)[5]的方法并略作改動(dòng)：將高良姜油和HP-β-CD按質(zhì)量比1∶8進(jìn)行投料。準(zhǔn)確稱取3.534 g的HP-β-CD溶解于100 mL蒸餾水中制成HP-β-CD飽和水溶液。另取0.495 mL高良姜油溶于20 mL無(wú)水乙醇中制成高良姜油-乙醇溶液。將HP-β-CD飽和水溶液放入恒溫?fù)u床，在40 r/min、45 ℃下攪拌1 h，邊搖邊緩慢滴入高良姜油-乙醇溶液。取出冷卻至室溫后放入冰箱（4 ℃）冷藏24 h，真空抽濾，減壓蒸餾回收乙醇，然后放入真空冷凍干燥機(jī)干燥96 h，研碎后過(guò)80 目篩，得到白色粉末狀包合物。平行制備3 份。

1.3.1.2 超聲法

參考文獻(xiàn)[5]的方法并略作改動(dòng)：同1.3.1.1節(jié)制得高良姜油-乙醇溶液，然后將HP-β-CD飽和水溶液放入超聲波清洗機(jī)，緩慢滴加高良姜油-乙醇溶液，40 r/min、45 ℃下超聲1 h。取出冷卻至室溫后放入冰箱（4 ℃）冷藏24 h，真空抽濾，減壓蒸餾回收乙醇，然后放入真空冷凍干燥機(jī)干燥96 h，研碎后過(guò)80 目篩，得到白色粉末狀包合物。平行制備3 份。按公式（1）計(jì)算兩種制備方法的得率。

1.3.2 包合率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[6]的方法，準(zhǔn)確稱取包合物的質(zhì)量，將包合物置于圓底燒瓶中，加300 mL蒸餾水和幾粒沸石，連接揮發(fā)油測(cè)定器，保持微沸直到油量不再增加時(shí)停止加熱，放置1 h，至高良姜油呈淡黃色時(shí)讀數(shù)，得到高良姜油的體積，并按照公式（2）計(jì)算包合率。

1.3.3 高良姜油-HP-β-CD包合物的表征

1.3.3.1 顯微鏡觀察

用吸管吸取新制備的高良姜油-HP-β-CD包合物與HP-β-CD溶液各一滴分別置于載玻片上，涂勻并分散開(kāi)，在光學(xué)顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)。

1.3.3.2 TLC法測(cè)定

參考文獻(xiàn)[4]的方法，將包合物中餾出的揮發(fā)油和高良姜油加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，同時(shí)稱取適量高良姜油-HP-β-CD包合物、HP-β-CD和HP-β-CD與高良姜油的物理混合物制成飽和溶液。分別吸取上述5 種溶液各10 μL，并依次點(diǎn)于同一個(gè)硅膠板上，用正己烷-乙醚（體積比8∶2）作為展開(kāi)劑，取出晾干后噴灑體積分?jǐn)?shù)5%香草醛-濃硫酸試劑，并在105 ℃下烘至斑點(diǎn)清晰顯色。

1.3.3.3 FT-IR法測(cè)定

參考文獻(xiàn)[7]的方法，分別稱取高良姜油、HP-β-CD、高良姜油-HP-β-CD包合物、HP-β-CD與高良姜油的物理混合物，將樣品和KBr按質(zhì)量比1∶100混合，用瑪瑙研缽研磨至紅外光下不反光為止，壓片，并在4 000～400 cm-1范圍掃描，得到FT-IR圖譜。

1.3.3.4 UV法測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]的方法，分別取適量高良姜油、HP-β-CD、高良姜油-HP-β-CD包合物、HP-β-CD與高良姜油的物理混合物溶解于純甲醇中并定容至25 mL，然后置于雙光束UV-可見(jiàn)分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)掃描，以純甲醇為空白，測(cè)定其吸光度。

1.3.4 高良姜油-HP-β-CD包合物水溶性觀察

稱取等質(zhì)量的高良姜油和高良姜油-HP-β-CD包合物分別放入兩支試管，依次加入10 mL蒸餾水，用力振蕩，觀察對(duì)比其水溶性。

1.3.5 高良姜油-HP-β-CD包合物抗氧化活性的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9-10]的方法并略作改動(dòng)：各取2 mL質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的高良姜油、高良姜油-HP-β-CD包合物以及高良姜油與HP-β-CD的物理混合物，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用力振蕩使其混合均勻，置于室溫下避光反應(yīng)30 min。在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度記為Ai，同時(shí)測(cè)定2 mL DPPH-乙醇溶液+2 mL乙醇的吸光度記為A0，2 mL樣品溶液+2 mL乙醇的吸光度記為Aj。所有測(cè)定平行3 次，并按公式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.5.2 ·OH清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法并略作改進(jìn)：取5 支試管分別加入1 mL 1.5 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer salinen，PBS），加入0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的高良姜油、高良姜油-HP-β-CD包合物以及高良姜油與HP-β-CD的物理混合物各2 mL于試管中，再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，用力振蕩使其充分混勻，最后加入體積分?jǐn)?shù)0.01% H2O21 mL，保持37 ℃下恒溫反應(yīng)45 min后，在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度記為As。用1 mL蒸餾水代替H2O2，測(cè)得吸光度記為Ab，用1 mL蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度記為Ap。所有測(cè)定平行3 次，羥自由基（·OH）清除率按公式（4）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5.3 還原能力的測(cè)定

取質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的高良姜油、高良姜油-HP-β-CD包合物以及高良姜油與HP-β-CD的物理混合物各2.5 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS（pH 6.6）和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃的恒溫水浴中保溫20 min，再加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，在3 000 r/min下離心10 min。取3.5 mL上清液與0.5 mL去離子水和0.5 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液混合均勻，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。所有測(cè)定平行3 次。

1.3.5.4 對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用

參考文獻(xiàn)[1 2-1 3]的方法并略作改動(dòng)：建立CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系。使Phen、Cu2+、VC和DNA的最終濃度分別為3.5×10-3、2.0×10-4、2.0×10-3mol/L和質(zhì)量濃度150 μg/mL。在樣品池中依次加入200 μL質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的高良姜油、高良姜油-HP-β-CD包合物以及高良姜油與HP-β-CD的物理混合物溶液、1.6 mL DNA/Cu2+/Phen體系溶液和200 μL VC，混勻后置于化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x中，打開(kāi)記錄系統(tǒng)，立即注入400 μL H2O2溶液，啟動(dòng)發(fā)光裝置，每隔4 s采集數(shù)據(jù)1 次，記錄9 min內(nèi)的總發(fā)光強(qiáng)度CL2，用蒸餾水做對(duì)照測(cè)總發(fā)光強(qiáng)度CL1，不加H2O2溶液時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度為本底發(fā)光強(qiáng)度CL0，按公式（5）計(jì)算DNA損失抑制率。

1.3.5.5 對(duì)UV誘導(dǎo)RBC溶血的影響

參照文獻(xiàn)[14-15]的方法并略作改動(dòng)，分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%綿羊RBC懸液4 mL，再按梯度質(zhì)量濃度分別加入0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL高良姜油、高良姜油-HP-β-CD包合物以及高良姜油與HP-β-CD的物理混合物，用生理鹽水補(bǔ)加至同等體積，空白管以生理鹽水代替樣品補(bǔ)足，各管溶液最終體積為8 mL，同時(shí)設(shè)VE作為陽(yáng)性對(duì)照組?；靹蚝笾糜?7 ℃水浴保溫10 min，然后用30 W UV燈照射30 min，置于4 ℃冰箱中放置24 h，2 500 r/min離心5 min取上清液，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，對(duì)UV誘導(dǎo)RBC溶血的影響以溶血抑制率表示，按公式（6）計(jì)算。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品吸光度。

1.3.6 對(duì)阻斷亞硝胺合成的影響

參考文獻(xiàn)[16-17]的方法并略作改動(dòng)，在100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%氯化鈉溶液中加入7 mL濃鹽酸，再加入胃蛋白酶6.0 g，加去離子水定容至1 000 mL，混勻即獲得人工模擬胃液。取1 mL模擬胃液，再加入質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的高良姜油，高良姜油-HP-β-CD包合物以及高良姜油與HP-β-CD的物理混合物溶液20 μL，0.1 mL 0.07 mmol/L亞硝酸鈉，0.1 mL 1 mmol/L二甲胺；用去離子水定容至2.5 mL，搖勻后置于37 ℃水浴1 h。取1 mL混合液，加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% Na2CO3溶液于UV分析儀中照射15 min。再加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%對(duì)氨基苯磺酸溶液、1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% α-萘胺溶液、0.5 mL去離子水，搖勻后靜置15 min。用UV-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定在538 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按公式（7）計(jì)算對(duì)亞硝胺合成的阻斷率。

式中：A0為不加樣品時(shí)的吸光度；A為加入樣品后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件處理分析，以3 個(gè)平行樣品的±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜油-HP-β-CD包合物制備方法的篩選結(jié)果

分別采用飽和水溶液法和超聲法制備高良姜油-HP-β-CD包合物，結(jié)果顯示飽和水溶液法制備的包合率為78.31%，得率為89.53%；超聲法的包合率為72.64%，得率為83.27%。比較兩種包合方法，飽和水溶液法制備的高良姜油-HP-β-CD包合率和得率均顯著高于超聲法（P＜0.05），因此選用飽和水溶液法制備。

2.2 高良姜油-HP-β-CD包合物的鑒定結(jié)果

2.2.1 顯微鏡觀察結(jié)果

圖 1 HP-β-CD（a）與高良姜油-HP-β-CD包合物（b）的顯微鏡觀察（16×10）Fig. 1 Microscopic observation of HP-β-CD (a) and inclusion complex with the essential oil (b) (16 × 10)

由圖1可看出，HP-β-CD呈透明狀，高良姜油-HP-β-CD包合物內(nèi)含黑色不透明物質(zhì)，可初步判斷高良姜油已包埋于HP-β-CD中。與郭濤等[18]大蒜油的包合物的顯微鏡觀察結(jié)果一致。

2.2.2 TLC分析結(jié)果

圖 2 高良姜油-HP-β-CD包合物及其組分的TLC圖譜Fig. 2 TLC analysis of the essential oil, HP-β-CD, and their inclusion complex and physical mixture

由圖2可知，樣品1、2、5在相同位置顯現(xiàn)的斑點(diǎn)幾乎一致，樣品3、4幾乎無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)。從樣品1、2的鑒定結(jié)果可以看出包合前后高良姜油的TLC圖譜基本一致，說(shuō)明其成分幾乎無(wú)變化；樣品2、3、5的TLC鑒定結(jié)果表明，包合過(guò)程與簡(jiǎn)單的物理混合有所不同，包合物形成了一種新的物相，且形成的高良姜油-HP-β-CD包合物較穩(wěn)定。

2.2.3 FT-IR分析結(jié)果

圖 3 高良姜油-HP-β-CD包合物及其組分的FT-IR光譜Fig. 3 FT-IR spectra of the essential oil, HP-β-CD, and their inclusion complex and physical mixture

從圖3中可以看出，高良姜油在1 745 cm-1附近有一個(gè)特征吸收峰，高良姜油與HP-β-CD的物理混合物在該處也有特征吸收峰，而HP-β-CD和高良姜油-HP-β-CD包合物在該處沒(méi)有吸收[19]；包合后高良姜油在756、1 162、1 456、1 745、2 926 cm-1處的特征吸收峰被HP-β-CD的吸收峰掩蓋了，而且高良姜油與HP-β-CD的物理混合物與高良姜油-HP-β-CD包合物的FT-IR光譜圖也有不同，這表明包合不是簡(jiǎn)單的混合，而是有了新物相的形成。高良姜油-HP-β-CD包合物在2 934 cm-1處的締合羥基峰與未包合的高良姜油相比更寬更強(qiáng)，說(shuō)明高良姜油與HP-β-CD形成了氫鍵，從而增強(qiáng)了高良姜油的水溶性。

圖 4 高良姜油-HP-β-CD包合物及其組分的UV光譜Fig. 4 UV absorption spectra of the essential oil, HP-β-CD, and their inclusion complex and physical mixture

2.2.4 UV分析結(jié)果由圖4可看出，高良姜油、高良姜油和HP-β-CD的物理混合物在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)均有吸收，但是后者的波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移，這可能是受到HP-β-CD的影響[20]，但是兩者的光譜行為大體相同。而高良姜油-HP-β-CD包合物與高良姜油及其與HP-β-CD的物理混合物的圖譜有明顯的區(qū)別，而與HP-β-CD相似，這說(shuō)明包合過(guò)程不是簡(jiǎn)單的物理混合，而是有了新物相的形成。

2.3 高良姜油-HP-β-CD包合物的水溶性觀察

圖 5 包合前后高良姜油水溶性對(duì)比Fig. 5 Water solubility of the essential oil before and after inclusion

從圖5可以看出，包合前高良姜油漂浮在水面，不溶于水；而包合后高良姜油被均勻地分散在水溶液中，包合作用使高良姜油的水溶性大幅提高。

2.4 高良姜油-HP-β-CD包合物的抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力分析

圖 6 包合后高良姜油DPPH自由基清除能力的變化Fig. 6 DPPH radical scavenging capacity of the essential oil and its inclusion complex

由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍（0.5～8.0 mg/mL）內(nèi)，高良姜油、高良姜油與HP-β-CD的物理混合物及高良姜油-HP-β-CD包合物均具有一定的清除DPPH自由基的能力，并且呈劑量依賴性，隨著質(zhì)量濃度的升高，其清除能力升高。當(dāng)濃質(zhì)量度為8.0 mg/mL時(shí)，三者DPPH自由基清除率分別達(dá)65.8%、65.2%和68.3%，可以看出包合后清除DPPH自由基的能力略有上升，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.4.2 ·OH清除能力分析

圖 7 包合前后高良姜油·OH清除能力的變化Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging capacity of the essential oil and its inclusion complex

如圖7所示，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍（0.5～8.0 mg/mL）內(nèi)，高良姜油、高良姜油與HP-β-CD的物理混合物及高良姜油-HP-β-CD包合物均具有一定的清除·OH的能力，并且呈劑量依賴性，隨著質(zhì)量濃度的升高，其清除能力升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí)，三者·OH清除率分別達(dá)70.8%和70.2%和82.3%，包合后清除·OH的能力顯著提高（P＜0.05），在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)提高幅度達(dá)16.2%～40.7%。

2.4.3 還原能力分析

測(cè)定物質(zhì)的還原能力是確定其抗氧化活性的一種方法，物質(zhì)的還原能力通常與抗氧化活性之間存在顯著的正相關(guān)，還原能力可以一定程度上反映抗氧化活性[21-22]。鐵氰化物中的Fe3+被抗氧化物質(zhì)還原成Fe2+，溶液顏色變綠。根據(jù)所測(cè)吸光度評(píng)價(jià)還原能力。

圖 8 包合前后高良姜油還原能力的變化Fig. 8 Reducing power of the essential oil and its inclusion complex

從圖8可看出，隨著高良姜油質(zhì)量濃度的增加，吸光度也隨之增加，并且高良姜油-HP-β-CD包合物的吸光度顯著高于未經(jīng)包合的高良姜油（P＜0.05），在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增幅達(dá)16.67%～61.63%，表明高良姜油-HP-β-CD包合物的還原能力得到顯著提升。

2.4.4 對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用分析

在CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系中，利用Cu2+與VC發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有強(qiáng)氧化性的·OH，同時(shí)Phen在金屬離子的催化下與H2O2作用生成·OH，當(dāng)·OH離DNA作用位點(diǎn)很近并且濃度相對(duì)集中時(shí)將對(duì)DNA造成損傷[23-24]。

圖 9 高良姜油及其HP-β-CD包合物對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig. 9 Protective effect of the essential oil and its inclusion complex on DNA damage

從圖9可以看出，在此體系內(nèi)，高良姜油-HP-β-CD包合物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用略大于未包合的高良姜油，但差異不顯著（P＞0.05），8.0 mg/mL的包合物對(duì)DNA氧化損傷的抑制率達(dá)94.1%。

2.4.5 對(duì)UV誘導(dǎo)RBC溶血的影響

表 2 高良姜油及其HP-β-CD包合物對(duì)UV誘導(dǎo)的RBC溶血的影響Table 2 Inhibitory effect of the essential oil and its inclusion complex on UV-induced hemolysis of RBC

由表2可知，高良姜油、高良姜油-HP-β-CD包合物及VE均具有一定的抗UV誘導(dǎo)的RBC溶血的能力，并且均呈濃度依賴性，質(zhì)量濃度越高，抑制率越大。雖然在相同質(zhì)量濃度下，高良姜油及高良姜油-HP-β-CD包合物的抗RBC溶血能力弱于陽(yáng)性對(duì)照VE，但高良姜油-HP-β-CD包合物的抗RBC溶血能力顯著高于未包合的高良姜油（P＜0.05）。RBC溶血實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)生物抗氧化活性的常用方法之一[25-27]。RBC膜富含對(duì)自由基非常敏感的多不飽和脂肪酸，UV照射RBC懸液，激發(fā)產(chǎn)生的·OH攻擊RBC膜上的多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，致使膜通透性增加，引起血紅蛋白滲出導(dǎo)致溶血[28]。高良姜油及其包合物能抑制UV導(dǎo)致的RBC溶血作用，說(shuō)明其能抑制RBC膜的·OH氧化損傷。結(jié)果表明，包合后高良姜油的抗RBC溶血作用得到顯著提升。

2.5 對(duì)抑制亞硝胺合成的影響

亞硝胺是一種典型的強(qiáng)致癌物，能引起人和動(dòng)物胃、肝臟等多種器官的惡性腫瘤[29]。在胃內(nèi)酸性條件下，胺類物質(zhì)和亞硝酸鹽很容易結(jié)合產(chǎn)生亞硝胺，利用天然化合物阻斷這一反應(yīng)過(guò)程，可在一定程度上預(yù)防亞硝胺對(duì)人體帶來(lái)的潛在危害[30]。

圖 10 高良姜油及其HP-β-CD包合物對(duì)抑制亞硝胺合成的影響Fig. 10 Inhibitory effect of the essential oil and its inclusion complex on nitrosamine synthesis

圖10顯示，在0.5～8.0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著高良姜油質(zhì)量濃度的增加，對(duì)亞硝胺合成的阻斷率均逐漸升高，表明高良姜油及高良姜油-HP-β-CD包合物均可有效地阻斷亞硝胺的合成。在同等質(zhì)量濃度下，包合物對(duì)亞硝胺合成的阻斷率顯著大于未包合的高良姜油（P＜0.05）。結(jié)果表明，包合后高良姜油抑制亞硝胺合成的能力顯著提升。

3 結(jié) 論

采用飽和水溶液法制備高良姜油-HP-β-CD包合物優(yōu)于超聲法制備。通過(guò)顯微鏡觀察、TLC法、FT-IR法、UV光譜法等分析手段鑒定了高良姜油-HP-β-CD包合物的形態(tài)，表明高良姜油被成功包合，包合前后高良姜油的組成幾乎無(wú)變化，不僅很好地保留了高良姜油的主要特征成分，并可通過(guò)冷凍干燥把難溶于水的液態(tài)狀的高良姜油轉(zhuǎn)化為易溶于水的固體粉末，很大程度上改善了高良姜油的水溶性和穩(wěn)定性，并能掩蓋其氣味，減少刺激性。為開(kāi)發(fā)高良姜油新產(chǎn)品并進(jìn)一步將其制成藥片、沖劑、泡騰片、飲料等產(chǎn)品以及拓寬其用途提供了依據(jù)。

通過(guò)測(cè)定和分析高良姜油及高良姜油-HP-β-CD包合物對(duì)·OH、DPPH自由基的清除能力和還原能力、對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用、對(duì)UV誘導(dǎo)的RBC溶血的影響以及在模擬胃液條件下其阻斷亞硝胺合成作用的變化，表明高良姜油及高良姜油-HP-β-CD包合物具有較好的·OH、DPPH自由基清除能力和較高的還原能力，對(duì)DNA氧化損傷具有保護(hù)作用，并且能有效抑制亞硝胺的合成；包合后高良姜油的抗氧化活性及抑制亞硝胺合成的能力得到顯著提升。