定量DCE-MRI和QCT評價兔糖尿病模型骨髓微血管滲透性和骨小梁改變的相關(guān)性

陳翩翩，查云飛，2*

糖尿病骨髓脂肪生成增加、骨髓微血管病變等導(dǎo)致的骨髓和多器官功能障礙已引起廣泛關(guān)注[1]。糖尿病病人患骨折、退變及骨質(zhì)疏松等骨病的風(fēng)險明顯增加，且治療效果往往比同類疾病的非糖尿病患者更差[2-3]，顯示骨髓組織是糖尿病另一個重要的靶器官[4-5]。最新研究結(jié)果顯示骨髓微血管改變是糖尿病骨髓病變的重要特征[6]。Hu等[7]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示動態(tài)對比增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI)灌注參數(shù)可以反映糖尿病早期骨髓通透性的改變，DCE-MRI 技術(shù)可以用評估脊柱骨髓微血管病變。定量計算機(jī)斷層掃描(quantitative computed tomography，QCT) QCT采用的是三維體積CT數(shù)據(jù)，測量的是真正的體積骨密度[8]，與其他投影技術(shù)(DXA等)測量的面積骨密度相比，QCT在糖尿病骨病評價中有其獨(dú)特的優(yōu)勢。

糖尿病骨髓微血管病變、骨密度、骨結(jié)構(gòu)、骨轉(zhuǎn)換及骨折風(fēng)險評估的復(fù)雜關(guān)系尚待深入研究[2，9-10]。本研究旨在應(yīng)用定量DCE-MR和QCT評價四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病椎體骨髓微血管滲透性參數(shù)與骨密度和骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，探索QCT 能否反映早期兔糖尿病腰椎骨小梁微結(jié)構(gòu)改變。

1 材料與方法

1.1 兔糖尿病模型的建立

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會審查通過，由武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供健康成年雄性日本大耳白兔24只，空腹體重2.8～3.1 kg，平均(3.0±0.1) kg。所有兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模，造模前均禁食不禁水12 h，測量空腹血糖，血糖值均＜6.0 mmol/L [(5.5±0.3) mmol/L]。隨機(jī)將兔分為實(shí)驗(yàn)組14只、對照組10只。將四氧嘧啶(Sigma公司)用0.9%的生理鹽水配制成5%的溶液，按照100 mg/kg的劑量快速由耳緣靜脈注入實(shí)驗(yàn)組兔體內(nèi)，對照組則注入同等劑量的生理鹽水，之后自由進(jìn)食、進(jìn)水。48 h后，用血糖儀(三諾安信血糖儀)測量外周血糖濃度。單次外周血糖測量值≥14 mmol/L或者兩次測量值≥11 mmol/L被認(rèn)定為造模成功[11]。對于48 h后血糖值仍正常的實(shí)驗(yàn)組兔，則補(bǔ)加50 mg/kg 的四氧嘧啶溶液，直至血糖達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。隨后4周內(nèi)每周進(jìn)行血糖水平監(jiān)測。4周以后兩組兔血糖水平趨于穩(wěn)定。此后每隔4周行MRI檢查前測量其血糖值。

1.2 影像學(xué)檢查

1.2.1 MRI檢查方法

在造模成功后0、4、8、12、16周，對實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液(1.3 ml/kg)進(jìn)行麻醉。麻醉后將兔仰臥位足先進(jìn)固定于8通道膝關(guān)節(jié)專用相控陣線圈，采用3.0 T超導(dǎo)MR機(jī)(Discovery MR750 Plus，GE Healthcare)對實(shí)驗(yàn)兔腰椎行矢狀位FSE-T1WI、FSE-T2WI及DCE-MRI檢查。矢狀位FSE-T1WI掃描參數(shù)：TR 300 ms，TE Min Full，層厚3 mm，層間距0 mm，F(xiàn)OV 160 mm×160 mm，矩陣320×288。矢狀位FSE-T2WI掃描參數(shù)：TR 2500 ms，TE 120 ms，層厚3 mm，層間距0 mm，F(xiàn)OV 160 mm×160 mm，矩陣320×320。

DCE-MRI序列：掃描參數(shù)：采用肝臟快速容積采集(liver acquisition volume acceleration，LAVA)序列及陣列空間敏感編碼技術(shù)(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)。首先行多反轉(zhuǎn)角LAVA序列掃描(TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，層厚3 mm，F(xiàn)OV 200 mm×160 mm，矩陣192×192，Chem SAT：Special，反轉(zhuǎn)角為9°及12°)，每個多反轉(zhuǎn)角序列掃描一個時相(8 s)。隨后行動態(tài)增強(qiáng)LAVA序列掃描(TR 3.5 ms，TE 1.0 ms，層厚3.0 mm，F(xiàn)OV 200 mm×160 mm，矩陣192×192，反轉(zhuǎn)角10°)，連續(xù)無間隔同層掃描420幀動態(tài)圖像，總計掃描35個時相。在基線掃描2個動態(tài)時相之后通過美國MeoRao雙筒高壓注射器經(jīng)兔耳緣靜脈團(tuán)注對比劑，對比劑采用歐乃影(釓雙胺，GE Healthcare，Ireland)，注射劑量為0.2 mmol/kg，流率為1.0 ml/s，隨后同樣流率注射0.9%生理鹽水5 ml沖管。

1.2.2 CT檢查方法

QCT掃描：麻醉后將兔取常規(guī)仰臥位并使下肢伸直，在腰部底下加墊固體體模(V.4.0)，利用GE Bright Speed 16排螺旋CT對腰4～7椎體進(jìn)行螺旋掃描。掃描過程中需要使掃描線與椎體上下緣平行，掃描參數(shù)：管電壓120 kv，管電流250 mAs，床高179 cm，螺距0.531，SFOV=Large body，矩陣512×512，層厚5 mm，標(biāo)準(zhǔn)算法重建。

1.2.3 DCE-MRI及QCT圖像后處理及參數(shù)測定

將DCE-MRI原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Omni-Kinetics (GE Healthcare)軟件進(jìn)行分析。首先對35期動態(tài)增強(qiáng)圖像進(jìn)行3D非剛性運(yùn)動校正(3D non-rigid registration)，以降低呼吸運(yùn)動偽影，然后導(dǎo)入兩個反轉(zhuǎn)角(9°和12°) LAVA序列圖像，用于T1 mapping的計算，再將校正后的35期增強(qiáng)圖像導(dǎo)入，選擇腹主動脈內(nèi)的對比劑時間濃度曲線作為腰椎的動脈輸入函數(shù)(arterial input function，AIF)，藥代動力學(xué)模型選擇擴(kuò)展Tofts模型。在圖像的每一層面手動勾畫感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，避開椎間盤、椎基靜脈叢、骨島，采用merge功能將每個層面ROI圖像融合為三維感興趣區(qū)域(VOI)，軟件自動計算出容量轉(zhuǎn)移常數(shù)(Ktrans)、速率常數(shù)(Kep)、血管外細(xì)胞外間隙(extravascular extracellular space，EES)容積分?jǐn)?shù)(Ve)(均取mean值)，重復(fù)測量三次，取各參數(shù)平均值為最終結(jié)果(圖1)。

將CT圖像上傳至Mindways Pro后處理軟件測量兔腰4～7椎骨密度值(bone mineral density，BMD)，ROI不包括骨島、椎靜脈孔、病損區(qū)域等(圖2)。

1.3 腰椎組織病理學(xué)檢查及骨小梁形態(tài)計量學(xué)

在第16周完成檢查后，所有實(shí)驗(yàn)兔采取空氣栓塞法處死，取腰7椎體采用通用型組織固定液(4%多聚甲醛的緩沖溶液，pH為中性)固定，脫鈣、石蠟包埋，選取腰椎體最大橫斷面作4 μm厚薄切片，行HE染色。在光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX51)高倍鏡下(×40)選取4個獨(dú)立的相同面積區(qū)域進(jìn)行觀察并拍片。應(yīng)用ImagePro Plus 6 (Media Cybermetic，Inc. USA)軟件對圖像進(jìn)行分析，測量HE染色切片中骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁面積(Tb.Ar)(圖3)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用Pearson相關(guān)性分析第16周糖尿病組兔腰椎骨髓微血管滲透性參數(shù)與骨密度和骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的相關(guān)性；采用重復(fù)測量方差分析各組腰椎骨髓滲透性參數(shù)及BMD隨時間變化的趨勢，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間腰椎骨髓微血管滲透性參數(shù)、骨密度、骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病組兔因麻醉、身體健康狀況差死亡4只，剩余10只。對照組因麻醉因素意外死亡2只，剩余8只。糖尿病組、對照組不同時間點(diǎn)腰椎滲透參數(shù)及BMD服從正態(tài)分布，球形檢驗(yàn)結(jié)果P＞0.05，因此采用重復(fù)測量的方差分析。不同時間點(diǎn)滲透參數(shù)Kep、Ve在對照組差異分別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，而在糖尿病組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。對照組不同時間點(diǎn)滲透參數(shù)差異進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。對照組腰椎Kep在第4周到12周呈下降趨勢，第16周有所回升，但仍舊低于第0周水平，Ve在第4周到12周呈上升趨勢，第16周下降，但仍舊高于第0周水平(P＜0.05)。(表1；圖4～6)。不同時間點(diǎn)BMD在對照組及糖尿病組差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表1；圖7)。

表1 糖尿病組、對照組各時間點(diǎn)兔腰椎DCE-MRI滲透性參數(shù)和BMD值比較(±s)Tab. 1 Comparison of DCE-MRI permeability parameters and BMD values of lumbar spine between diabetic group and control group at different time points (±s)

表1 糖尿病組、對照組各時間點(diǎn)兔腰椎DCE-MRI滲透性參數(shù)和BMD值比較(±s)Tab. 1 Comparison of DCE-MRI permeability parameters and BMD values of lumbar spine between diabetic group and control group at different time points (±s)

注：a代表對照組內(nèi)與0周比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；b代表同一點(diǎn)時間糖尿病組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

時間點(diǎn) 對照組 糖尿病組 t值 P值Ktrans 0周 2.95±0.06 2.91±0.11 0.836 0.417 4周 2.95±0.06 2.76±0.45 1.203 0.267 8周 2.93±0.08 2.74±0.45 1.115 0.283 12周 2.95±0.10 2.77±0.40 1.262 0.228 16周 2.93±0.07 2.70±0.71 0.997 0.390 Kep 0周 6.71±1.26 5.42±1.94 1.573 0.138 4周 4.80±0.98a 5.66±1.82 -1.176 0.259 8周 5.16±1.29a 4.22±1.66 1.260 0.228 12周 4.25±1.03a 4.31±1.81 -0.074 0.942 16周 5.76±1.48a 5.03±2.20 0.784 0.446 Ve 0周 0.40±0.17 0.59±0.32 -1.465 0.165 4周 0.69±0.13a 0.49±0.21 2.276 0.039b 8周 0.64±0.19a 0.75±0.19 -1.097 0.291 12周 0.76±0.15a 0.72±0.25 0.394 0.700 16周 0.52±0.25 0.61±0.22 -0.767 0.456 BMD 0周 531.25±56.29 522.81±58.44 0.265 0.796 4周 525.28±63.48 514.45±54.22 0.327 0.75 8周 520.95±44.87 510.39±88.04 0.266 0.789 12周 519.53±44.97 464.63±58.73 1.909 0.083 16周 502.63±39.35 451.69±46.17 2.151 0.055

圖1 為第16周對照組增強(qiáng)T1WI圖及基于該圖像后處理獲得的Ktrans、Kep、Ve及Vp圖，紅色區(qū)域?yàn)槭謩庸串嫵龅难礡OI 圖2 QCT后處理勾畫ROI區(qū)域Fig. 1 Enhanced T1WI images of the control group and Ktrans, Kep, Ve and Vp images obtained based on the image post-processing at week 16, the red areas are the lumbar rois manually outlined. Fig. 2 ROI area delineated by QCT post-processing.

圖3 Image Pro plus軟件標(biāo)記并勾畫需要測量的骨小梁輪廓 圖4～7 分別為糖尿病組、對照組腰椎Ktrans、Kep、Ve和BMD隨時間變化趨勢圖。對照組腰椎Kep呈先下降后回升趨勢，Ve呈先上升后回降趨勢 圖8，9 分別為第16周糖尿病組、對照組腰椎(HE ×40)，糖尿病組腰椎骨小梁分布稀疏，面積較小(箭；圖8)；對照組兔腰椎骨小梁數(shù)多，面積較大(箭；圖9) Fig. 3 The trabecular bone contour to be measured is marked and sketched by the Image Pro plus software. Fig. 4—7 Shows the trend of lumbar Ktrans, Kep, Ve and BMD changes over time in the diabetes group and the control group, respectively. In the control group, the Kep of lumbar spine first decreased and then increased, and the Ve first increased and then decreased. Fig. 8, 9 Shows HE staining of lumbar vertebrae in the diabetes group at week 16 and the control group (HE ×40), respectively. Lumbar vertebral trabeculae in the diabetes group are sparsely distributed with small area (arrow. Fig.8). The lumbar vertebral trabeculae of rabbits in the control group were large in number and area (arrow. Fig. 9).

第16周糖尿病組腰椎HE染色顯示骨小梁數(shù)量、面積減小(圖8，9)。糖尿病組骨小梁計數(shù)、骨小梁面積低于對照組(t=12.472；t=4.961；P＜0.001)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示Tb.N與Ktrans、Kep、Ve均無相關(guān)性(r值分別為0.135、0.093、-0.118；P＞0.05)，Tb.Ar與Ktrans、Kep、Ve均無相關(guān)性(r值分別為0.233、-0.008、-0.095；P＞0.05)。

BMD與Ktrans、Kep、Ve均無相關(guān)性(r值分別為0.497、0.513、-0.310；P＞0.05)。

3 討論

本研究首次采用DCE-MRI定量滲透性參數(shù)結(jié)合QCT的BMD評估四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病骨髓微循環(huán)及骨密度的變化，研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組16周腰椎骨髓微血管DCE-MRI滲透性參數(shù)與骨面積、骨小梁數(shù)及相對骨小梁面積參數(shù)及BMD之間均無相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)組BMD值在0～16周均未出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的變化，而骨小梁形態(tài)計量學(xué)在16周時已出現(xiàn)明顯變化。

無論是T1 DM還是T2 DM，早期糖尿病骨髓微血管病變的病理生理機(jī)制尚未闡明[12-13]。糖尿病引起的骨代謝紊亂主要包括骨量減少和骨質(zhì)疏松。糖尿病合并骨髓微血管病變時，將會加重骨的代謝障礙。對那些已患有原發(fā)性骨質(zhì)疏松的病人，再患有糖尿病將會使骨代謝障礙的病情加重[14]。Oikawa等[13]首次顯示T1 DM大鼠的股骨、脛骨骨髓微血管病變，包括：骨髓脂肪細(xì)胞堆積以及骨量減少；微血管通透性增高、血流量減少；小動脈、毛細(xì)血管網(wǎng)及骨髓竇狀隙減少。Hu等[7]的研究結(jié)果顯示四氧嘧啶(ALX)誘導(dǎo)的兔糖尿病模型成功12周后，兔椎體骨髓微血管通透性及脂肪含量明顯增加，骨髓微血管密度減低，骨髓成骨細(xì)胞微環(huán)境破壞。目前T2 DM相關(guān)骨組織形態(tài)計量學(xué)的研究主要集中于骨代謝而非骨結(jié)構(gòu)[15]，T2 DM患者的骨組織結(jié)構(gòu)與健康對照組相比，具有明顯多孔的皮質(zhì)和具有高骨小梁vBMD和厚度[16-17]，無骨結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組16周四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病腰椎骨髓微血管DCEMRI滲透性參數(shù)與骨面積、骨小梁數(shù)及相對骨小梁面積參數(shù)及BMD之間均無相關(guān)性。Rakic等[21]的研究顯示T2DM患者BMD與糖尿病病程無相關(guān)性；產(chǎn)生這個結(jié)果的原因，可能是因?yàn)樘悄虿趋老到y(tǒng)的損害為骨強(qiáng)度的改變，而BMD只能反映骨強(qiáng)度的一個方面，BMD也許不能全面反映這種損害[22]。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中筆者推測糖尿病早期骨髓微血管滲透性改變與BMD及骨小梁指標(biāo)的變化不存在相關(guān)性，但是不能因此排除糖尿病病程與骨密度減低嚴(yán)重程度的相關(guān)性。確認(rèn)骨髓微血管病變是糖尿病骨病的中心因素還是糖尿病骨病的誘因，對臨床預(yù)測糖尿病骨病風(fēng)險及其防治具有重要參考價值，需要在微血管病發(fā)展之前就開始長期的前瞻性研究，同時進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)研究，以便更好地了解骨髓微血管病與BMD改變和骨折風(fēng)險之間的關(guān)系。

Ramiya等[23]研究結(jié)果顯示從成年非肥胖糖尿病小鼠的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞分離出細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)形成了胰島樣結(jié)構(gòu)移植到小鼠的腎囊或皮下組織后，可以逆轉(zhuǎn)該小鼠胰島素依賴的糖尿病。本實(shí)驗(yàn)第4周到第16周骨髓Kep水平下降，Ve水平上升可能是由于胰腺的自我修復(fù)能力所致。另外，有明確證據(jù)表明高血糖與微血管疾病之間具有因果關(guān)系[24-25]以及調(diào)節(jié)血糖控制在防止微血管疾病中的重要性[26]。本次實(shí)驗(yàn)過程中血糖監(jiān)測結(jié)果顯示第4周以后部分糖尿病兔血糖水平呈下降趨勢，這也是實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病兔模型滲透性參數(shù)變化趨勢的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兔糖尿病組腰椎BMD呈下降趨勢，但在16周不同時間點(diǎn)的差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，這在Register等[20]的研究結(jié)果也可得到證實(shí)。而第16周時糖尿病組與對照組腰椎骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，并且BMD與骨小梁指標(biāo)之間無明確的相關(guān)性。筆者推測QCT測量的腰椎BMD的變化并不能完全準(zhǔn)確地反映組織學(xué)上骨小梁形態(tài)計量學(xué)的變化。通過微有限元分析(micro-FEA)估計的骨強(qiáng)度顯示，與對照組相比，2型糖尿病患者骨強(qiáng)度較低，與橈骨遠(yuǎn)端皮質(zhì)孔隙率增加有關(guān)[27-28]。此外，與沒有骨折的2型糖尿病患者相比，有骨折的2型糖尿病患者的骨皮質(zhì)疏松和小梁異質(zhì)性更明顯[29]。最近HR PQCT研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種皮質(zhì)缺損僅出現(xiàn)在糖尿病微血管并發(fā)癥患者身上[30]。與無骨折的2型糖尿病患者相比，有骨折的2型糖尿病患者中皮質(zhì)和骨膜層的皮質(zhì)空隙率更高，這表明這些皮質(zhì)亞室可能對2型糖尿病引起的毒性更敏感，并可能反映微血管疾病[31]。本次實(shí)驗(yàn)中，QCT測量BMD時勾畫的ROI避開了皮質(zhì)區(qū)域，這可能是導(dǎo)致BMD下降趨勢不明顯的一個重要原因。未來的研究應(yīng)更多地從評價骨脆性的結(jié)構(gòu)決定因素(微觀結(jié)構(gòu)、材料性質(zhì))入手來評價QCT測量糖尿病兔模型腰椎BMD的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

本研究存在一些不足。首先，本次實(shí)驗(yàn)對象是動物模型，研究時長僅為16周，與臨床糖尿病患者慢性代謝性疾病自然病程存在差異，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能說明糖尿病早期骨髓微血管滲透性改變與BMD的變化不存在相關(guān)性，而二者之間的完整時序變化規(guī)律仍有待進(jìn)一步研究；其次，本實(shí)驗(yàn)所有兔腰椎QCT檢查實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)多次進(jìn)行DCE-MRI檢查，未能評價靜脈注射釓劑對腰椎QCT測量結(jié)果的影響；最后，本實(shí)驗(yàn)未能在實(shí)驗(yàn)全程對骨小梁標(biāo)本結(jié)果進(jìn)行連續(xù)多期觀察，在后續(xù)開展的研究中有待進(jìn)一步完善。

綜上所述，四氧嘧啶兔糖尿病早期腰椎骨髓微血管滲透性參數(shù)變化與骨密度和骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)無相關(guān)性，QCT測量的骨髓BMD變化晚于骨小梁形態(tài)計量學(xué)的變化。

利益沖突：無。