發(fā)酵蘋果汁對腹瀉小鼠稀便率和小腸組織結構的影響

王 婧，李 瑞，王吉祥，宮澤恩，孫子龍，王曉聞

（1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

腹瀉是臨床上經常出現(xiàn)的一種病癥，而且在各種動物養(yǎng)殖業(yè)中也會頻繁發(fā)生，若不及時對其采取措施進行診治，將會造成動物的大批死亡，從而對各大養(yǎng)殖場造成無法估量的經濟損失[1]。當機體處于健康狀態(tài)時，腸黏膜能夠阻擋細菌和病毒等穿過；但是當腸道黏膜的防御作用下降時，這些有害的物質就會透過黏膜誘發(fā)各種疾病。因此，腹瀉與腸黏膜防御之間有著十分密切的關系?？股叵嚓P性腹瀉是由于濫用或過量使用抗生素，從而導致機體的抗生素耐藥性增加[2]，是臨床上使用抗菌類藥物過程中所發(fā)生的最為多見的副作用，尤其是氨基青霉素類、頭孢菌素類等相對廣譜的抗生素[3-4]。

益生菌的使用是調節(jié)腸道菌群的一種治療措施，可以幫助恢復腸道微生物群并重建腸道內穩(wěn)態(tài)[5-6]。URDACI 等[7]研究表明，用枯草芽孢桿菌或植物乳桿菌處理可以減少由脂多糖（Lipopolysaccharides，PS）誘導的腹瀉。益生菌是有利于宿主健康的活的微生物，其存在于健康人類的腸道中，能夠促進營養(yǎng)物質的消化吸收，提高機體免疫力，維持腸道菌群結構平衡，已被用于調節(jié)胃腸道微生物群和治療各種腸道疾病，并且具有極好的安全效益比。OZDAL 等[8]研究表明，蘋果是世界上最受歡迎的水果之一，其含有豐富的多酚和纖維，能夠通過增加有益細菌來調節(jié)微生物。有研究表明，干酪乳桿菌對于保護斷奶仔豬的腸道具有很好的效果，同時提高了淋巴細胞的數(shù)目，增強了機體的免疫機能[9-10]。

本研究利用1%的植物乳桿菌在pH 值為7.0的條件下發(fā)酵新鮮蘋果汁24 h 得到的發(fā)酵蘋果汁處理腹瀉小鼠，通過統(tǒng)計各組小鼠的稀便率以及對于小腸各段進行組織病理學觀察，探討發(fā)酵蘋果汁對腹瀉小鼠腸黏膜的作用和對小腸結構的完整性的影響，旨在為進一步深入研究發(fā)酵蘋果汁的功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 供試蘋果為紅富士，購自山西省晉中市山西農業(yè)大學農貿市場；植物乳桿菌CICC21809，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；供試動物為健康的SPF 級ICR 小鼠45 只，3 周齡、雄性，由山西醫(yī)科大學提供。

1.1.2 試劑 頭孢曲松鈉，購自北京索萊寶有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵蘋果汁的制備 將低溫保藏的菌種活化后，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置24 h，使菌液濃度達約1.0×107cfu/mL。新鮮蘋果汁的pH 值在4.0 左右，通過食用堿（Na2CO3）調節(jié)蘋果汁pH 值到6.5，121 ℃高壓滅菌10 min；待果汁冷卻后，在超凈工作臺上進行分裝，根據(jù)不同發(fā)酵條件將其接種到50 mL 果汁中，接種后的蘋果汁放置在37 ℃恒溫箱內進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將乳酸菌菌種活化后，接種于乳酸細菌發(fā)酵培養(yǎng)基（MRS）中，37 ℃培養(yǎng)24 h，使菌液濃度達約1.0×107cfu/mL。

1.2.3 動物分組及給藥 將45 只小鼠適應性飼養(yǎng)7 d 后，隨機分為5 個組（對照組、模型組、未發(fā)酵蘋果汁組、發(fā)酵蘋果汁組和乳酸菌組），每天對各組小鼠進行2 次灌胃，第1 次是在9：00，其中，對照組每只小鼠灌胃0.3 mL 的無菌生理鹽水，模型組、未發(fā)酵蘋果汁組、發(fā)酵蘋果汁組和乳酸菌組每只小鼠各灌胃等量的頭孢曲松鈉溶液。第2 次是在4 h后，將各組每只小鼠單獨放在一個鼠籠里，對照組和模型組每只小鼠灌胃0.3 mL 的無菌生理鹽水，未發(fā)酵蘋果汁組給予等量的新鮮蘋果汁，發(fā)酵蘋果汁組給予等量的發(fā)酵蘋果汁，乳酸菌組灌胃等量的MRS 菌液；之后觀察2 h，期間記錄各組小鼠的稀便情況和正常的小鼠數(shù)量，并進行統(tǒng)計。第8 天將全部小鼠脫頸處死，并無菌收集各個小鼠的十二指腸、空腸和回腸，置于4%多聚甲醛中固定48 h，期間換一次固定液，保存于75%的乙醇中。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 稀便率測定 將各組的每只小鼠分別放置在一個鼠籠里，2 h 內統(tǒng)計每只小鼠的總排便數(shù)和所排稀便數(shù)，計算稀便率。

稀便率＝2 h 內所排稀便數(shù)/ 每只小鼠總排便數(shù)×100% （1）

1.3.2 腸道組織形態(tài)學觀察 根據(jù)方磊涵等[11]的方法，無菌采集十二指腸、空腸和回腸，沿橫截面橫切成適當大小，生理鹽水沖洗后固定，進行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋流程，使用切片機切成5 μm厚的連續(xù)切片，挑選出完整的組織烘干后用于HE染色。染色時，先對切片進行二甲苯脫蠟，用梯度乙醇浸泡，再用蘇木精染色5 min，自來水沖洗1 min后，利用1%的鹽酸- 乙醇溶液來分色，再用自來水沖洗5 min；用梯度乙醇逐步脫水；在伊紅染液中浸入30 s 后快速倒掉染液；再用高濃度的乙醇進行脫水，在二甲苯中透明20 min 后，中性樹膠封片，放置過夜后在顯微鏡下觀察并對完整的組織進行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用Graph Pad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析，稀便率采用One- way ANOVA 進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理小鼠稀便率的變化

從圖1 可以看出，在第3 天，對照組及各試驗組的小鼠與模型組相比均無顯著性變化（P＞0.05）；第4 天時，對照組、乳酸菌組和發(fā)酵蘋果汁組的小鼠與模型組相比，稀便率均顯著下降（P＜0.05）；與發(fā)酵蘋果汁組相比，未發(fā)酵蘋果汁組稀便率顯著上升（P＜0.05）；第5～7 天，各組小鼠的稀便率均無顯著性變化（P＞0.05）。

2.2 不同處理小鼠十二指腸的形態(tài)學觀察結果

從圖2 可以看出，各試驗組小鼠腸道具有明顯的變化，在低倍鏡下，對照組、未發(fā)酵蘋果汁和發(fā)酵蘋果汁組的十二指腸絨毛呈長指狀和彎曲狀，結構完整，絨毛與隱窩界限分明，無明顯病理變化；而模型組出現(xiàn)腸絨毛的斷裂、漂浮，隱窩和腸絨毛雜亂無序。

2.3 不同處理小鼠空腸的形態(tài)學觀察結果

圖3 結果顯示，對照組、未發(fā)酵蘋果汁組、益生菌組和發(fā)酵蘋果汁組的腸絨毛排列整齊，與隱窩界限分明，無明顯病理變化，且發(fā)酵蘋果汁組的絨毛較長；模型組觀察到腸絨毛的斷裂縮短。

2.4 不同處理小鼠回腸的形態(tài)學觀察結果

圖4 結果顯示，對照組、益生菌組、發(fā)酵蘋果汁組的腸絨毛和隱窩排列緊密整齊，結構相對完整；模型組和未發(fā)酵果汁組能夠看到明顯的絨毛斷裂和縮短。

3 結論與討論

抗生素誘導的小鼠腹瀉是構建動物腹瀉模型最為常用的方法，通常都是小鼠灌胃7 d 左右即可形成。

仔豬腹瀉是目前養(yǎng)殖場中常見的問題，吳蘇君等[12]研究表明，仔豬腹瀉與腸道菌群變化相關。絨毛是小腸最重要的黏膜組成部分，機體的各種消化吸收也是利用腸絨毛進行的[13]。因此，腸絨毛對于小腸的吸收功能具有最直接的作用。絨毛越長，說明消化吸收越強。隱窩是絨毛基部的上皮內陷形成的管狀結構[14]，隱窩深度則反映了細胞的生成率和小腸的更新速度，更新過程減慢，就會導致隱窩變淺，表明成熟細胞較多，吸收消化能力增強[15]。

有研究證明，枯草芽孢桿菌能夠增加成年的雄性雞中的回腸絨毛長度，從而提高飼料轉化率[16]。CHICHLOWSKI 等[17]用屎腸球菌處理肉雞，結果顯示，空腸和回腸的絨毛變長。當給動物喂乳桿菌后，黏膜出現(xiàn)了更多的褶皺，絨毛變長，增加了飼料的利用率[18]。郭元晟等[19]試驗結果表明，乳酸桿菌對于肉雞腸絨毛的增長具有促進作用。魏俊淑[20]研究表明，植物乳桿菌能夠減緩葡聚糖硫酸鈉誘導形成的結腸炎小鼠的腸道組織學損壞。本試驗結果表明，發(fā)酵蘋果汁能增加腸絨毛高度，促進小鼠腸黏膜的發(fā)育。小鼠腹瀉后，腸道中的水分會變多，會促進糞便的軟化，對腸黏膜也會產生一定的刺激，從而造成黏膜損害。小鼠灌服發(fā)酵蘋果汁后，其腸絨毛損傷較輕，說明發(fā)酵蘋果汁能夠減輕腹瀉對腸黏膜的刺激，對腸絨毛的完整性起到一定的保護作用。

本研究表明，與其他試驗組相比，發(fā)酵蘋果汁能夠顯著降低腹瀉小鼠的稀便率，并且能夠使腹瀉模型小鼠的腸絨毛提高，說明發(fā)酵蘋果汁在一定程度上能夠保護腸黏膜，促進其生長，增加腸道黏液屏障的防御功能，減輕腸黏膜損傷，從而保護腸道。