采用熒光顯微技術(shù)對(duì)棗瘋病病原進(jìn)行鑒定

申仲妹，陳紅玉，楊俊強(qiáng)，馬光躍，薛新平，郭建民，孫錫峰，連永宏

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031；2.永和縣林業(yè)局，山西永和041400）

棗瘋病也稱作“棗癌癥”，它是一種由植原體所引起的維管束系統(tǒng)侵染性病害[1-8]。在棗樹生產(chǎn)上典型癥狀表現(xiàn)為花變?nèi)~和叢枝，患病較輕的棗樹會(huì)出現(xiàn)花臉果現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致樹體死亡。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前山西省沿黃棗區(qū)都有棗瘋病發(fā)病現(xiàn)象，有的地方棗瘋病出現(xiàn)成片發(fā)病、全園發(fā)病、全園絕收的情況。目前該病原還未能進(jìn)行離體培養(yǎng)。

本試驗(yàn)利用越冬期枝條水培方法，采用熒光染料（DAPI）染色技術(shù)，對(duì)條棗感病枝條和健康枝條的幼莖進(jìn)行了對(duì)比診斷研究，旨在為快速、便捷、定性定量判斷棗瘋病病原提供技術(shù)支撐[9-13]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別在2018 年1 月18 日、3 月9 日采集山西省臨汾市永和縣打石腰鄉(xiāng)河澮里村棗園條棗的病枝和健枝用于水培試驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器

5%戊二醛溶液（50%戊二醛用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋而成）、0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）（取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液29.1 mL，用水稀釋至100 mL 即得）、1.0 μg/mL DAPI（100 μg/mL DAPI 用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液稀釋而成）、1%霍蘭格營養(yǎng)液。

落射式olympusDP72 熒光顯微鏡、BLC- 300 人工氣候箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 越冬枝條的水培試驗(yàn) 水培液體分為蒸餾水、1%霍蘭格營養(yǎng)液2 種。在200 mL 燒杯中放置5～8 枝30 cm 長條棗品種的枝條，分別加入100 mL水培液體。每隔2 d 換1 次水培液體，將原先的枝段用清水沖洗干凈，將枝條末端剪成馬蹄截面，再次放入新液體中。將燒杯放入人工氣候箱中培養(yǎng)，使其萌發(fā)抽枝達(dá)3～5 cm，即可測(cè)定水培枝條的總枝條數(shù)、總芽數(shù)、萌芽數(shù)、成枝數(shù)。每個(gè)處理3 次重復(fù)。人工氣候箱內(nèi)環(huán)境條件為：溫度25 ℃，濕度70%，光暗間隔時(shí)間分別為光照16 h，黑暗8 h。

1.3.2 DAPI 熒光顯微檢測(cè)觀察[14]

1.3.2.1 試材固定 將水培后萌發(fā)的棗吊離體后固定在5%戊二醛溶液中，并保存在4 ℃冰箱中至少2 h 后待用。

1.3.2.2 切片 將試材從5%戊二醛溶液中取出并用清水沖洗干凈，用嶄新刀片將棗吊的幼嫩組織切成厚薄均勻的小圓片。

1.3.2.3 DAPI 染色 將40～50 片切片浸泡在為1.0 μg/mL DAPI 染色劑中染色15～20 min。

1.3.2.4 熒光顯微觀察 將染好色的切片15～20 片放置在載玻片上，加上蓋玻片后用吸紙將四周液體吸干，將其放置在落射式olympus DP72 熒光顯微鏡下鏡檢，WU（紫光）激發(fā)，透射光365 nm，阻濾光420 nm，觀測(cè)并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2003 初步處理后，采用方差分析軟件進(jìn)行新復(fù)極差多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 條棗品種越冬期枝條水培情況調(diào)查

從表1 可以看出，條棗的病枝與健枝通過水培后病枝萌芽率為32.7%，健枝的萌芽率為64.4%，相應(yīng)的成枝率病枝為24.5%，健枝為47.5%；但從枝條芽數(shù)看，病枝芽數(shù)為98 個(gè)，健枝芽數(shù)為59 個(gè)，它們之間存在極顯著差異，但是萌芽數(shù)與成枝數(shù)上二者間并不存在顯著差異。究其原因，病枝患病后前期用于叢枝生長消耗大量枝條營養(yǎng)，從而導(dǎo)致越冬枝條形成的新芽不飽滿，影響第2 年的正常生長。為了確保棗瘋病病原的正常觀測(cè)，建議試材用量為：30 cm 長的枝條，病枝數(shù)量至少是健枝數(shù)量的1 倍以上。

表1 條棗品種越冬期枝條水培情況調(diào)查

2.2 條棗品種越冬期枝條不同液體水培情況調(diào)查

表2 條棗品種越冬期枝條不同液體水培情況調(diào)查

從表2 可以看出，由于培養(yǎng)枝條的液體不同萌芽率也不同。病枝水培在蒸餾水中的萌芽數(shù)與水培在1%霍蘭格營養(yǎng)液中的萌芽數(shù)之間不存在顯著性差異，萌芽數(shù)稍低于水培在1%霍蘭格營養(yǎng)液的病枝，它們的萌芽率分別為21.7%，39.7%；但是健枝水培在蒸餾水中的萌芽數(shù)與水培在1%霍蘭格營養(yǎng)液的健枝存在極顯著差異，健枝的萌芽率分別為64.4%，92.9%。試驗(yàn)也說明為了獲取更多試驗(yàn)材料，通過補(bǔ)充外源營養(yǎng)物質(zhì)可彌補(bǔ)枝條本身營養(yǎng)欠缺的遺憾。

2.3 DAPI 染色條棗嫩莖中植原體觀察

經(jīng)DAPI 染色后，在落射式olympusDP72 熒光顯微鏡下觀察到，取自條棗病枝上的嫩莖橫切片中的韌皮部有云片狀或團(tuán)狀不規(guī)則的熒光帶呈現(xiàn)，且不均勻分布（圖1- A），而取自條棗健枝上的嫩莖橫切片中的韌皮部熒光大小一致，分布均勻（圖1- B）。

3 結(jié)論與討論

王秀伶等[14]在鑒定棗瘋病植原體的過程中強(qiáng)調(diào)，DAPI 是一種DNA 專化的熒光染料，當(dāng)它與DNA 結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光。植原體DNA 與DAPI 結(jié)合后產(chǎn)生的特異性熒光亮度大，且亮點(diǎn)有大有小，很不均勻，熒光亮點(diǎn)時(shí)常呈現(xiàn)團(tuán)狀或云片狀。李成亮[15]研究認(rèn)為，DAPI 本身的熒光極其微弱，但與DNA 結(jié)合后復(fù)合物的熒光度驟然上升，是檢測(cè)DNA 的高效熒光染料。本試驗(yàn)結(jié)果與此相吻合。

條棗的病枝與健枝通過水培后從枝條芽數(shù)看，它們之間存在極顯著性差異，但是從萌芽數(shù)與成枝數(shù)上二者并不存在顯著性差異。究其原因，病枝患病后前期用于叢枝生長消耗大量枝條營養(yǎng)，從而導(dǎo)致越冬枝條形成的新芽不飽滿，影響第2 年的正常生長。

由于培養(yǎng)枝條的液體不同，萌芽率也不同：病枝水培在蒸餾水中的萌芽數(shù)與水培在1%霍蘭格營養(yǎng)液中的萌芽數(shù)之間不存在顯著性差異，萌芽數(shù)稍低于水培在1%霍蘭格營養(yǎng)液的病枝，它們的萌芽率分別為21.7%，39.7%；但是健枝水培在蒸餾水中的萌芽數(shù)與水培在1%霍蘭格營養(yǎng)液的健枝相比它們存在極顯著差異，健枝的萌芽率分別為64.4%，92.9%。試驗(yàn)也說明為了獲取更多試驗(yàn)材料，通過補(bǔ)充外源營養(yǎng)物質(zhì)可彌補(bǔ)枝條本身營養(yǎng)欠缺的遺憾。

本試驗(yàn)通過采集越冬期條棗品種棗瘋病枝條對(duì)其進(jìn)行水培，以正常枝條水培為對(duì)照，采用熒光顯微技術(shù)（DAPI）對(duì)水培枝條的幼莖進(jìn)行對(duì)比診斷研究，結(jié)果表明，越冬期枝條水培采集最佳時(shí)間為1 月；水培溶液為1%霍蘭格營養(yǎng)液；試材需固定在5%戊二醛溶液放置4 ℃冰箱2 h 以上、1.0 μg/mL DAPI 染色劑中染色20 min，便可快速、便捷、定量定性判斷棗瘋病病原。DAPI 染色技術(shù)作為檢測(cè)植原體侵染的一種手段，可在藥物防治棗瘋病的篩選研究工作中加以應(yīng)用。