耐鉛菌與生物炭、有機(jī)肥配施對(duì)鉛污染土壤的修復(fù)效果

郜雅靜，李建華，靳東升，盧晉晶，籍晟煜，張?jiān)讫?，郜春?/p>

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原030031）

鉛作為農(nóng)業(yè)環(huán)境中主要的重金屬污染元素之一，主要隨著大量礦山的挖掘，工業(yè)廢氣、廢水、廢渣的亂排，農(nóng)業(yè)肥料的噴施，日常垃圾的堆棄等途徑，沉積到農(nóng)田土壤中，且很難被降解，最終隨著土壤—植物—?jiǎng)游镏鸺?jí)累積，最終進(jìn)入人體，對(duì)人類的健康和生存構(gòu)成威脅[1]。我國(guó)是一個(gè)典型的生產(chǎn)與消耗鉛的大國(guó)，每年鉛礦開采量高達(dá)90 萬(wàn)t，其中，超過(guò)40萬(wàn)t 被消耗[2]。2010 年李國(guó)平[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)糧食含Pb 量大于1.0 mg/kg 的產(chǎn)地有11 個(gè)。鉛是土壤中很常見(jiàn)并且分布十分廣泛、含量也較高的重金屬元素[4]，它可以通過(guò)改變土壤微生物活性，影響土壤生態(tài)平衡，導(dǎo)致土壤功能失調(diào)、土質(zhì)惡化等一系列環(huán)境問(wèn)題。

目前，重金屬污染土壤修復(fù)已經(jīng)開展了許多工作，就修復(fù)技術(shù)比較，生物修復(fù)具有費(fèi)用低、效果好等優(yōu)勢(shì)，具有良好的發(fā)展前景[5-6]。由于某些微生物對(duì)污染土壤中的重金屬具有氧化還原、吸附、沉淀的作用，它們可以通過(guò)降低重金屬的毒性，改善植物根際環(huán)境，增加土壤肥力，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。但是直接施加微生物可能會(huì)導(dǎo)致微生物流失或被吞噬，對(duì)重金屬的固定能力有限，而且微生物生長(zhǎng)的代謝能力不佳。一些研究將微生物吸附于載體上，再加入污染土壤中，發(fā)現(xiàn)載體可以為微生物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)源和保護(hù)區(qū)域，有利于微生物較快適應(yīng)新環(huán)境[7]。所以本研究運(yùn)用生物強(qiáng)化技術(shù)，將耐鉛菌聯(lián)合生物炭、有機(jī)肥來(lái)修復(fù)鉛污染土壤，以提高修復(fù)效率。

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所農(nóng)業(yè)微生物課題組前期從太原市重金屬污染土壤中篩選出耐鉛菌（GDYX03），通過(guò)16S rDNA 序列分析鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter），利用透射電鏡和紅外光譜分析該菌可知，其主要依靠細(xì)胞表面吸附Pb2+。確定了該菌株在鉛污染水體中吸附的最佳條件是菌齡72 h，pH 值5～6，接菌量5 g/L，溫度30 ℃，時(shí)間30 min，初始Pb2+濃度100 mg/L，在此最佳條件下吸附率達(dá)98.85%，吸附量達(dá)19.73 mg/g[8]。生物炭具有孔隙大、表面活性大、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于重金屬的修復(fù)。另外，它還具有性質(zhì)極穩(wěn)定的碳結(jié)構(gòu)，能夠增加有機(jī)質(zhì)含量、增強(qiáng)土壤肥力[9]、改良土壤性質(zhì)、增加作物產(chǎn)量[10]。有機(jī)肥能夠?yàn)槲⑸锾峁┧璧酿B(yǎng)分，提高微生物在土壤中的代謝能力。同時(shí)，有機(jī)肥的加入，還可以提高土壤肥力、促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)換，疏松土壤、改善土壤微環(huán)境。

本試驗(yàn)將耐鉛菌分別聯(lián)合生物炭、有機(jī)肥對(duì)鉛污染土壤的修復(fù)效果進(jìn)行研究，以期為重金屬鉛污染修復(fù)提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 其由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所農(nóng)業(yè)微生物課題組從太原市污染土壤中分離篩選，經(jīng)鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter ludwigii）GDYX03。該菌株形態(tài)呈擴(kuò)展形，表面光滑凸起，易挑起，乳白色且半透明，為革蘭氏陰性菌。

1.1.2 供試載體 市售的生物炭、商品有機(jī)肥，其基礎(chǔ)性質(zhì)分別列于表1，2。

表1 生物炭理化性質(zhì)

表2 有機(jī)肥的養(yǎng)分含量

1.1.3 供試作物 青美油菜（Brassica napus L.），購(gòu)于山西瑞豐種業(yè)。

1.1.4 供試污染土壤制備 添加一定濃度的外源鉛溶液，加入去離子水，使土壤水分達(dá)到田間持水量的70%，充分混勻裝入塑料框中，干濕交替，老化10 個(gè)月，獲得一定鉛濃度的試驗(yàn)土壤[11]，具體性質(zhì)列于表3。

表3 土壤基礎(chǔ)性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置12 個(gè)處理（表4）。所用土壤過(guò)2 mm篩，載體與土壤混勻后裝盆，每盆2 kg 土，同時(shí)加入基肥20 g（N∶P2O5∶K2O＝4∶3∶3）從育苗盤挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻的3 株移入，以稱重法保持土壤含水量在田間持水量的75%左右。4 個(gè)菌梯度分4 次加入，生長(zhǎng)時(shí)間55 d。生物炭和有機(jī)肥用量參考王婷[7]試驗(yàn)的用量。

1.3 樣品采集

1.3.1 植株樣品的采集 收獲時(shí)，用小鏟子將植株完整地從盆中輕輕挖出，分離地上、地下部，先用自來(lái)水沖洗干凈泥土，再用去離子水沖洗干凈，105 ℃殺青30 min，然后65 ℃烘干，粉碎，裝入自封袋中儲(chǔ)存，用于測(cè)定植株鉛含量。

表4 耐鉛菌與生物炭、有機(jī)肥配施的試驗(yàn)處理 g/kg

1.3.2 土壤樣品的采集 挖起植株，采用抖落法收集根區(qū)土壤，用滅過(guò)菌的鑷子去除土壤中的雜質(zhì)，其中，一部分裝入已編號(hào)的無(wú)菌自封袋，置于4 ℃冰箱，盡快進(jìn)行微生物活性分析；一部分風(fēng)干、磨碎、過(guò)篩，用于土壤中鉛含量的測(cè)定和土壤酶活性的分析。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 植株鉛含量 加入硝酸，高氯酸酸化，使用微波消解儀消解，采用火焰原子吸收分光光度計(jì)（240FSAA）測(cè)定植株鉛含量（mg/kg）[12]。

1.4.1.1 土壤有效態(tài)鉛含量 用DTPA（二乙三胺五乙酸）浸提劑（0.005 mol/L DTPA＋0.1 mol/L TEA（三乙醇胺）＋0.01 mol/LCaCl2） 浸提，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 采用火焰原子吸收分光光度計(jì)（240FSAA）測(cè)定土壤有效鉛含量（mg/kg）[13]。

1.4.1.2 土壤總鉛含量 加入鹽酸- 硝酸- 氫氟酸- 高氯酸酸化，微波消解儀消解，采用火焰原子吸收分光光度計(jì)（240FSAA）測(cè)定土壤總鉛含量（mg/kg）[13]。

1.4.2 土壤酶活性 脲酶活性采用苯酚鈉- 次氯酸鈉比色法測(cè)定；磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法測(cè)定；蔗糖酶活性采用3，5- 二硝基水楊酸比色法[14]測(cè)定。過(guò)氧化氫酶活性采用紫外分光光度法[15]測(cè)定。

1.4.3 土壤微生物數(shù)量 其采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定，其中，細(xì)菌培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)使用改良高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)使用孟加拉紅培養(yǎng)基[16]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)用4 個(gè)重復(fù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；差異顯著性用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行Duncan法檢驗(yàn)（P＜0.05 表示差異達(dá)顯著水平）。采用Microsoft Excel 2007 軟件作圖。

式中，C地上為油菜地上部鉛含量（mg/kg）；C地下為油菜地下部鉛含量（mg/kg）；C土壤為土壤殘留鉛含量（mg/kg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜生物量的影響

表5 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜生物量的影響

從表5 可以看出，與CK 相比，其他處理油菜地上部、地下部生物量都增加，地上部鮮質(zhì)量顯著增加，地下部鮮質(zhì)量（除J 處理外）、地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量除J、T 處理外，其余處理均顯著增加。F、J 配施處理的4 種生物量都大于T、J 配施處理，主要是由于加入的有機(jī)肥為鉛污染土壤帶來(lái)豐富的有機(jī)質(zhì)，改善了土壤性質(zhì)，提高了土壤肥力，促進(jìn)了植物生長(zhǎng)[17]。隨著接菌量的增加，油菜地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量4 種生物量都表現(xiàn)為先增大后減小。在生物炭、有機(jī)肥2 種載體與不同接菌量配施處理后，生物量分別在T＋J2、F＋J2 處理達(dá)到最大值，T＋J2 處理4 種生物量較CK 分別增加27.16%，40.59%，15.81%，35.71%；F＋J2 處理4 種生物量較CK 分別增加34.06%，84.12%，18.70%，77.86%。

2.2 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜鉛含量的影響

2.2.1 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜地上部鉛含量的影響 從圖1 可以看出，與CK 相比，各處理油菜地上部鉛含量均出現(xiàn)顯著降低，降幅達(dá)到11.96%～56.78%。CK、J、T、F 處理油菜地上部鉛含量由大到小分別為CK＞J＞F＞T。與CK 相比，T、J配施處理和F、J 配施處理的油菜地上部鉛含量降幅分別為49.33%～56.78%，20.78%～30.40%，T、J配施處理降幅較大。在生物炭、有機(jī)肥分別與4 個(gè)菌梯度配施處理中，隨著接菌量的增加，油菜地上部鉛含量先減少后增加，其中，T＋J2、F＋J2 處理油菜地上部鉛含量最低，分別為17.72，30.01 mg/kg。

2.2.2 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜地下部鉛含量的影響 由圖2 可知，耐鉛菌與吸附載體不同配施對(duì)油菜地下部鉛含量的影響與地上部鉛含量變化一致，與CK 相比，其他處理油菜地下部鉛含量也均顯著降低，且T、J 配施處理降低得較多。T、J 配施處理和F、J 配施處理油菜地下部鉛含量分別為309.90～329.32，334.95～370.08 mg/kg。其中，T＋J2、F＋J2 處理油菜地下部鉛含量最低，分別為309.90，334.95 mg/kg， 分別較CK 降低22.94%，16.71%。

與CK 相比，不同處理均能顯著降低油菜地上部、地下部鉛含量。這可能是因?yàn)橹参飳?duì)金屬的吸收量主要取決于土壤有效態(tài)重金屬濃度。耐鉛菌與生物炭、有機(jī)肥配施后可調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)養(yǎng)分活化，增加植物生物量；同時(shí)達(dá)到降低土壤有效態(tài)鉛含量的效果，減少了植物對(duì)鉛的吸附作用。董同喜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，畜禽糞便可降低水稻土中重金屬的生物有效性，進(jìn)而降低水稻的重金屬鉛含量；曹書苗等[19]通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，加入生物肥可降低黑麥草土壤有效態(tài)鉛含量，導(dǎo)致黑麥草地上和根部鉛含量降低。這與本研究結(jié)果相似。

2.3 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜中鉛轉(zhuǎn)移因子、富集系數(shù)的影響

由表6 可知，與CK 相比，其他處理油菜中鉛轉(zhuǎn)移因子和富集系數(shù)都降低。T、J 配施處理轉(zhuǎn)移因子、地上部富集系數(shù)、地下部富集系數(shù)、總富集系數(shù)較CK 分別降低37.23%～49.32%，24.15%～30.96%，50.27%～58.60%，25.84%～33.64%。F、J 配施處理轉(zhuǎn)移因子、地上部富集系數(shù)、地下部富集系數(shù)、總富集系數(shù)較CK 分別降低13.31%～21.75%，9.50%～20.54%，25.36%～36.68%，11.13%～22.03%。其中，T＋J2、F＋J2 處理地上部富集系數(shù)、地下部富集系數(shù)、總富集系數(shù)均最小，T＋J2 處理的3 種富集系數(shù)分別較CK 降低30.96%，58.60%，33.64%，F(xiàn)＋J2 處理的3 種富集系數(shù)分別較CK 降低20.54%，36.68%，33.64%。

鉛主要積累于植株根系中，地下部分對(duì)鉛的富集能力遠(yuǎn)高于地上部分，導(dǎo)致地下部分鉛含量高于地上部分。說(shuō)明鉛不易在植株體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，由轉(zhuǎn)運(yùn)因子也可以看出，加入吸附載體后增加了油菜生物量，降低了油菜地上部、地下部鉛含量，這有利于控制植株體內(nèi)的鉛殘留[20]。石汝杰等[21]研究發(fā)現(xiàn)，鉛更易于被黑麥草地下部吸收，不同處理地下部累積鉛含量均大于地上部，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。植株受鉛脅迫生長(zhǎng)后，隨著土壤中鉛含量增加，油菜地上部和地下部的鉛含量也增加，土壤中鉛含量與植株內(nèi)部鉛含量有一定的相關(guān)性。曹書苗[17]在研究黑麥草對(duì)鉛的耐受性和積累時(shí)也得出相似的結(jié)果。

表6 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)油菜中鉛轉(zhuǎn)移因子、富集系數(shù)的影響

2.4 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)土壤鉛含量的影響

2.4.1 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)土壤有效態(tài)鉛含量的影響 重金屬有效態(tài)可反映重金屬移動(dòng)性、毒性和生物有效性，其受土壤重金屬總量、有機(jī)質(zhì)含量等多種因素影響[22]。從圖3 可以看出，與CK相比，其他處理土壤有效態(tài)鉛含量均出現(xiàn)顯著降低，降幅達(dá)9.67%～21.76%。在生物炭、有機(jī)肥分別與4 個(gè)菌梯度配施處理中，T＋J2、F＋J2 處理土壤有效態(tài)鉛含量最低，較CK 分別降低21.76%，12.61%。加入生物炭對(duì)降低土壤有效態(tài)鉛含量效果較大，可能是因?yàn)樯锾坑泻艽蟮谋缺砻娣e，且?guī)ж?fù)電荷，能與重金屬陽(yáng)離子發(fā)生靜電吸附作用，吸附土壤中大量的重金屬離子，從而減少重金屬在土壤中的轉(zhuǎn)化[23]。CAO 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在200 ℃下制備的牛糞生物炭對(duì)土壤中Pb2+的吸附量最大達(dá)到680 mmol/kg。LU 等[25]研究表明，生物炭吸附土壤鉛離子的主要途徑是鉛離子與生物炭的含氧官能團(tuán)發(fā)生表面吸附以及在礦物質(zhì)表面生成絡(luò)合物。

2.4.2 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)土壤殘留鉛含量的影響 從圖4 可以看出，與CK 相比，其他處理土壤殘留鉛含量均增加，增幅達(dá)到2.47%～11.78%。在生物炭、有機(jī)肥分別與4 個(gè)菌梯度配施處理中，T＋J2、F＋J2 處理殘留鉛含量最大，分別為949.70，891.33 mg/kg， 分別較CK 增加11.78%，4.91%。通過(guò)添加生物炭、有機(jī)肥使土壤重金屬的固定增加，導(dǎo)致土壤有效態(tài)鉛含量降低，增加了土壤殘留鉛含量。因?yàn)樯锾繉?duì)土壤鉛含量的固定量多于有機(jī)肥，因此，生物炭與接菌量配施處理土壤殘留鉛含量較多。

2.5 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶活性一定程度上能夠反映土壤的養(yǎng)分含量和受污染程度。從表7 可以看出，耐鉛菌與2 種吸附載體配施后均能增加鉛脅迫下土壤過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性。2 種載體與不同接菌量配施處理后4 種酶活性均表現(xiàn)為先增大后減小，當(dāng)接菌量為J2（0.5 g/kg）時(shí)，酶活性最大。T＋J2處理過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性分別為1.674，4.258，0.053，0.451 mg/g；F＋J2 處理4 種酶活性分別為1.717，4.832，0.057，0.495 mg/g。

表7 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)土壤酶活性的影響

從表7 還可看出，生物炭與不同接菌量配施處理后過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶活性較CK分別增加0.92%～3.77%，2.70%～5.39%，6.14%～21.47%，4.68%～34.71%；有機(jī)肥與不同接菌量配施處理后4 種酶較CK 分別增加3.97% ～6.44%，11.28%～19.61%，14.39%～29.72%，30.00%～47.66%，4 種酶活性全部表現(xiàn)為F、J 配施處理較T、J 配施處理增加較大?？赡苁且?yàn)橛袡C(jī)肥能改善土壤的呼吸作用，增強(qiáng)土壤微生物活性，促進(jìn)土壤養(yǎng)分和能量轉(zhuǎn)化，對(duì)鉛污染土壤微環(huán)境有明顯的改善作用[26]。楊繼飛[27]研究發(fā)現(xiàn)，在鉛污染土壤上施用菌肥、腐植酸，能降低重金屬鉛的毒害，提高植株含量，增加根際土壤中活性，施用菌肥和腐植酸可以達(dá)到修復(fù)鉛污染土壤的目的。楊海征[28]研究發(fā)現(xiàn)，雞糞堆肥一定程度上提高了重金屬污染下茼蒿根際土壤中脲酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性。郭文娟等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中加入生物炭，均有增加土壤過(guò)氧化氫酶、脲酶、磷酸酶活性的作用，3 類酶分別增加10.2%～34.9%，18.0%～38.5%，0.7%～13.4%。

2.6 耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響

土壤微生物作為土壤生物特性的重要組成部分，是評(píng)價(jià)土壤環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)之一，比較耐鉛菌與不同吸附載體配施對(duì)微生物區(qū)系的影響（表8），結(jié)果表明，與CK 相比，不同處理土壤真菌、放線菌、細(xì)菌數(shù)量均顯著增加。隨接菌量的增加，耐鉛菌與生物炭、有機(jī)肥配施后真菌、放線菌數(shù)量均表現(xiàn)為先增加后減少，在2 種載體分別與J2 配施時(shí)達(dá)到最大值。其中，T＋J2 處理真菌、放線菌分別較CK增加59.39%，49.47%，F(xiàn)＋J2 處理真菌、放線菌分別較CK 增加72.68%，59.10%。隨著接菌量的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量表現(xiàn)為遞增趨勢(shì)，2 種載體分別與J4 配施后達(dá)到最大值，T＋J4、F＋J4 處理較CK 分別增加1 322.43%，1 470.93%。隨著接菌量的增加，土壤中細(xì)菌增加速度最快，主要是因?yàn)槟豌U菌本身是細(xì)菌，能在土壤中大量繁殖。馮莉等[30]研究發(fā)現(xiàn)，利用熒光假單胞菌能夠增加煙草根際土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，降低真菌的數(shù)量，這與本研究結(jié)果相似。3 類微生物數(shù)量均是F、J 配施處理較T、J 配施處理增加較多。這可能是因?yàn)橛袡C(jī)肥含有豐富的碳水化合物和N、P、K 等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，可提高土壤通氣性，不僅為微生物生長(zhǎng)提供碳源和氮源，還能創(chuàng)造良好的生存環(huán)境，刺激土壤中微生物生長(zhǎng)繁殖[31]。張連忠等[32]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥施用可提高果園根區(qū)土壤細(xì)菌、放線菌、真菌的數(shù)量，有機(jī)肥還可明顯減輕Cd、Cu 對(duì)土壤微生物的危害，減輕重金屬對(duì)土壤的污染。

3 結(jié)論

當(dāng)生物炭和有機(jī)肥作為載體分別以20 g/kg 添加量與0.5 g/kg 耐鉛菌配施時(shí)對(duì)鉛污染土壤修復(fù)效果最佳，有效減緩了鉛對(duì)蔬菜的脅迫作用，顯著促進(jìn)油菜的生長(zhǎng)，同時(shí)減少油菜體內(nèi)鉛富集，降低土壤有效態(tài)鉛含量、增加土壤酶活性和微生物多樣性。生物炭與有機(jī)肥作為外來(lái)營(yíng)養(yǎng)源不僅能夠作為耐鉛菌的載體，提供微生物生長(zhǎng)所需要的養(yǎng)分，顯著改善土壤生態(tài)環(huán)境，還可以吸附重金屬，提高生物強(qiáng)化技術(shù)對(duì)污染土壤的修復(fù)效果。