金櫻子總多酚降脂作用

李 娜，陳 倩，劉赫男，裴 剛，何桂霞?

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，肥胖現(xiàn)已成為當今社會的一種常見和多發(fā)性疾病。由于發(fā)病原因的多樣性以及發(fā)病機制的復雜性，使得肥胖成為世界衛(wèi)生組織確定的疑難性疾病之一，尋找到一種具有高效的減肥降脂作用的藥物成為醫(yī)學界的共同愿望，同時開發(fā)具有減肥降脂作用的食品藥品，對提高肥胖人群的生活質量，保護人體健康具有重要意義。

肥胖是指機體能量攝入超過能量消耗導致機體內(nèi)脂肪堆積過多及分泌異常所致的一種常見的慢性代謝性疾?。?］。脂肪組織在肥胖相關代謝綜合征的發(fā)展中發(fā)揮主要作用，它不僅是機體的能量貯存器官，調節(jié)能量代謝平衡，還是產(chǎn)生促炎細胞因子的重要場所，常見的促炎細胞因子有腫瘤壞死因子α（TNF-α）、C 反應蛋白（CRP）和白介素6（IL-6）等，最終誘發(fā)慢性炎癥，因此有學者稱，肥胖是一種低度的炎癥狀態(tài)［2-4］，且相關研究表明，其炎性細胞因子正是由脂肪組織內(nèi)的巨噬細胞產(chǎn)生［5-7］。

金櫻子Rosa laevigataMichx.為薔薇科薔薇屬植物，是一種藥食同源的植物果實，含有黃酮、多酚、多糖等活性物質，具有抗氧化、抑菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)、降糖降脂等多種藥理作用［8-10］?，F(xiàn)代的一些研究表明，許多疾病的發(fā)生都與人體內(nèi)存在過剩的自由基相關，比如某些藥物具有良好的降血脂作用，其作用機制可能與增強機體抗氧化能力有關，多酚由于其含有的羥基取代具有吞噬自由基的能力，而具有很好的抗氧化活性［11-12］。近年來，代謝性炎癥被認為在營養(yǎng)過剩導致肥胖等發(fā)生過程中起重要作用，大量研究也已證實多酚類物質具有很好的減肥降脂的作用［13-17］。因此，本研究以金櫻子多酚提取物對抗氧化、營養(yǎng)性肥胖小鼠的減肥降脂作用及巨噬細胞的炎癥作用等方面進行研究，初步探討金櫻子減肥降脂活性的機理。

1 材料

1.1 細胞株、動物 KM 雄性小鼠（清潔級，5周齡，體質量15～18 g，由湖南斯萊克景達實驗動物中心提供，使用許可證號SYXK（湘）2013-0005。RAW264.7細胞株購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 試藥 金櫻子藥材購于湖南省長沙市藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室肖冰梅教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物金櫻子的干燥果實，40 ℃烘干備用；DPPH（批號217-591-8，東京化成工業(yè)株式會社）；抗壞血酸（Vc）（批號B21293，上海市源葉生物科技有限公司）。GLU 試劑盒、TG 試劑盒、LDL 試劑盒、HDL 試劑盒（上海鈺博生物科技有限公司）；96孔板、細胞培養(yǎng)皿（上海晶安生物科技有限公司）；胰蛋白酶（美國Sigma 公司）、LPS（美國Sigma 公司）、NO 試劑盒（批號S0023，上海碧云天生物技術有限公司）。普通飼料（脂肪占10% 熱卡）、高級飼料（脂肪占60%熱卡）；高脂飼料配方為普通飼料65%、蛋黃粉10%、奶粉5%、豬油13%、蔗糖5%、食鹽（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供）。

1.3 儀器 TP5102電子天平（上海光正醫(yī)療有限公司）；AZ210分析天平（日本島津公司）；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHz-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空系（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DHG-9145A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一亙科技有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FRESCO 17冷凍高速離心機（美國Thermo 公司）；ELx800酶標儀（美國Biotek 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（美菱公司）。

2 方法

2.1 金櫻子總多酚提取物制備及含有量測定 金櫻子樣品加入70%的乙醇溶液冷浸提取，提取液濃縮至小體積，加入NaOH 溶液調pH 為10左右，靜置過夜，離心，去掉不溶雜質，加HCl 溶液，調pH 約為2，用等體積乙酸乙酯反復萃取，取乙酸乙酯層，回收溶劑，得到多酚浸膏。以沒食子酸為對照品，用Folin-Ciocalteu（F-C）法測定金櫻子總多酚含量為33.16%。

2.2 體內(nèi)降脂藥效

2.2.1 造模、分組及給藥 小鼠正常水食適應性喂養(yǎng)3 d后，將33只KM 雄性小鼠稱定質量標記后，隨機分為正常組、模型組、給藥組，每組11只。第1到22天正常組喂養(yǎng)普通飼料，模型組和給藥組喂養(yǎng)高脂飼料，服用方式都通過自由進食；第23到44天，模型組和給藥組均停止喂食高脂飼料，改為普通飼料，給藥組加喂金櫻子多酚提取物。

2.2.2 指標測定 每天定時記錄小鼠攝食量和飲水量，每周定時記錄體質量1次，觀察小鼠飲食、活動和糞便等一般情況。實驗結束后（第44天），禁食12 h 后，采用斷頭方法處死動物，收集全血，靜置2 h，離心15 min 后分離血清；快速液氮凍存，血樣-80 ℃冰箱保存待測。分別對小鼠血清中GLU、TG、LDL 及HDL 測定。按試劑盒要求的測定條件和程序測定，以濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標建立標準曲線，通過檢測OD 值計算樣品濃度。

2.3 體外抗氧化

2.3.1 供試品溶液制備 精密稱取金櫻子多酚提取物10 mg，置于10 mL 量瓶中，加入無水乙醇，并定容至刻度，再分別吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL 樣品溶液置于5 mL 量瓶中，定容至刻度，將濃度分別配置成0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mg／mL。

2.3.2 清除率測定 精密量取不同濃度的樣品溶液0.5 mL，分別加入0.004%的DPPH 溶液2.5 mL，搖勻，避光放置20 min 后在波長517 nm 測定吸光度Ai；以等體積70%乙醇代替供試品溶液，同法操作測定吸光度A0；以等體積70%乙醇代替DPPH 溶液，同法操作測定吸光度Ai0，以抗壞血酸（Vc）為陽性對照，質量濃度分別設置為0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mg／mL，平行測量3次，結果取平均值，DPPH 清除率=［1-（Ai-A0）／A0］×100%。

2.4 體外細胞抗炎活性

2.4.1 供試品溶液制備 取“2.1”項制備好的金櫻子多酚，用二甲基亞砜（DMSO）配置成50 mg／mL 貯備液，加藥時用無血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋成50 μg／mL 的供試品藥液。

2.4.2 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U／mL 青霉素及100 mg／L 鏈霉素）于細胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）內(nèi)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期進行傳代并進行分組實驗。

2.4.3 金櫻子總多酚對RAW264.7細胞生長的影響 采用CKK-8法檢測。按1×105／孔細胞接種RAW264.7細胞于96孔板，實驗分為10組。正常對照組，細胞用終濃度含有0.5%DMSO 的培養(yǎng)基處理；給藥組，分別用0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg／mL的金櫻子總多酚藥物處理；空白對照組，加無細胞的0.5%DMSO 培養(yǎng)基處理，每組設6個復孔。以上細胞孵育24 h后，用PBS 清洗2次，每孔先加新鮮培養(yǎng)基100 μL，再加CCK-8溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。在450 nm 處測量吸光度A值。細胞存活率=［（A實驗-A空白）／（A正常-A空白）］×100%。

2.4.4 金櫻子總多酚對LPS 干預的RAW264.7細胞中NO的影響 培養(yǎng)的RAW264.7細胞以1×105／孔種于96孔板。實驗分為6組，正常組，用終濃度含有0.5%DMSO 的培養(yǎng)基處理48 h；模型組，先用終濃度200 ng／mL LPS 處理24 h，再用終濃度含有0.5%DMSO 的培養(yǎng)基處理24 h；給藥組分為4組，都先用終濃度200 ng／mL LPS 處理24 h，后再分別用0.006 25、0.012 5、0.025、0.05 mg／mL 的金櫻子總多酚藥物處理24 h，每組設6個平行復孔，取細胞培養(yǎng)上清液，依照NO 試劑盒的操作步驟進行，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，在540 nm 處測量吸光度A 值，檢測培養(yǎng)細胞上清液中NO 濃度。

2.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較用單因素方差分析，2組間用t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 金櫻子總多酚對肥胖小鼠的體質量的影響 第0天時，正常組、模型組及給藥組體重無顯著性差別（P＞0.05）；第7天開始，模型組、給藥組小鼠體質量明顯高于正常組小鼠（P＜0.01）；第42天，與模型組比較，給藥組小鼠體質量降低（P＜0.01）。見表1。

表1 金櫻子總多酚對肥胖小鼠的體質量的影響（， n=11）

表1 金櫻子總多酚對肥胖小鼠的體質量的影響（， n=11）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01

3.2 金櫻子總多酚對肥胖小鼠GLU、TG、LDL 及HDL 水平的影響 給藥42 d 后，與正常組比較，模型組小鼠血清中GLU、LDL-C 水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），HDLC 水平明顯降低（P＜0.05），TG 無顯著性差異；與模型組比較，給藥組能明顯降低小鼠血清GLU、LDL-C（P＜0.05，P＜0.01）水平，升高HDL-C 水平（P＜0.01）。見圖1。

圖1 金櫻子總多酚對肥胖小鼠GLU、TG、LDL 及HDL 水平的影響

3.3 金櫻子總多酚對DPPH 自由基的活性的影響 在0.08～0.48 mg／mL 濃度范圍內(nèi)，隨著金櫻子多酚的濃度增加，DPPH 的自由基清除率也增加，IC50約為0.25 mg／mL，金櫻子多酚對DPPH 自由基有清除作用，但其清除能力弱于抗壞血酸。見表2。

3.4 金櫻子總多酚對RAW264.7細胞存活率的影響 與正常組比較，金櫻子總多酚濃度＜0.05 mg／mL 細胞存活率無顯著差別（P＞0.05），金櫻子總多酚濃度≥0.1 mg／mL 細胞存活率明顯降低（P＜0.01），說明金櫻子總多酚質量濃度低于0.05 mg／mL 時，對巨噬細胞增殖不會產(chǎn)生影響。見表3。

表2 金櫻子總多酚對DPPH 自由基的活性的影響（，n=3）

表2 金櫻子總多酚對DPPH 自由基的活性的影響（，n=3）

表3 不同劑量金櫻子總多酚對RAW264.7細胞存活率的影響結果（， n=6）

表3 不同劑量金櫻子總多酚對RAW264.7細胞存活率的影響結果（， n=6）

注：與正常組（金櫻子總多酚0 mg／mL）比較，??P＜0.01

3.5 金櫻子總多酚對LPS 干預的RAW264.7細胞中NO 的影響 與正常組比較，模型組NO 濃度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，金櫻子總多酚濃度≥0.012 5 NO 濃度顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 金櫻子總多酚對LPS 干預的RAW264.7細胞中NO的影響（， n=6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01

4 討論

本實驗以降血脂與抗氧化功能有關及肥胖是一種低度的炎癥狀態(tài)為依據(jù)，對藥食兩用植物金櫻子多酚提取物對抗氧化、營養(yǎng)性肥胖小鼠的減肥降脂作用及巨噬細胞的炎癥作用等方面進行相關研究?？寡趸钚匝芯恐?，在0.08～0.48 mg／mL 質量濃度范圍內(nèi)，隨著金櫻子多酚的質量濃度增加，對DPPH 的自由基清除率也隨之增加，實驗表明金櫻子多酚提取物具有良好的抗氧化活性。在減肥降脂作用研究中，通過建立體外飲食誘導的小鼠肥胖模型，用金櫻子多酚提取物進行干預，實驗結果說明金櫻子總多酚能降低小鼠體重、高脂小鼠血清的血糖濃度和LDL 濃度，升高高脂小鼠血清的HDL 濃度。在炎癥反應研究中，通過體外建立炎性反應模型，用LPS 刺激RAW264.7巨噬細胞，表明金櫻子總多酚能減輕巨噬細胞炎癥反應。以金櫻子多酚提取物分別做抗氧化、降脂和抗炎的研究只是提供了相關的理論基礎，因此在今后的研究中會使用不同劑量組和增加其他模型等進一步探討金櫻子總多酚減肥降脂作用機理。