• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的影響

    2019-11-21 06:03:54麗王秀秀錢薇楊蘊(yùn)智葛焱許正新
    中成藥 2019年11期
    關(guān)鍵詞:肌細(xì)胞乙素失活

    鄒 麗王秀秀錢 薇楊蘊(yùn)智葛 焱許正新

    (1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225000;2.江蘇省重點(diǎn)動(dòng)物傳染病和人畜共患病預(yù)防控制共創(chuàng)中心,江蘇 揚(yáng)州225001;3.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州225001;4.江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州225009)

    五味子,木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí),性味酸甘溫,具有寧心安神的功效,主治心神失養(yǎng)之虛煩心悸,失眠多夢(mèng)等癥狀。傳統(tǒng)中藥五味子以顯著的保肝作用而廣泛應(yīng)用于臨床[1-2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),五味子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]、心腦血管系統(tǒng)[4-5]、免疫系統(tǒng)[6]亦有良好作用。劉菊秀等[7]的研究結(jié)果提示,適當(dāng)劑量的五味子具有減弱心收縮力,減慢心率的作用。成分分析結(jié)果顯示,五味子含揮發(fā)性成分、木脂素和有機(jī)酸等[8]。其中,屬于聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素類的五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)具有許多有應(yīng)用前景的藥理作用[9]。胡開永等[10]報(bào)道,五味子乙素對(duì)阿霉素引起的心肌毒性具有保護(hù)作用;孫紅霞等[11]研究發(fā)現(xiàn),五味子乙素對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注(I/R)損傷具有一定保護(hù)作用。眾所周知,藥物引起的心臟毒性、心臟缺血再灌注損傷等一系列作用的產(chǎn)生與離子通道密切相關(guān),因此探索五味子乙素與離子通道之間的關(guān)系具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),探究五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞除極相的主要通道電流—鈉離子通道電流(INa)的影響。闡述五味子乙素與鈉通道有無關(guān)聯(lián),并為其今后的開發(fā)利用及更好地服務(wù)于臨床提供理論依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 SD 大鼠(250±20)g,雌雄不拘,揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供 [SCXK(蘇)2017-0044]。

    1.2 試藥 五味子乙素(成都埃爾法生物科技有限公司,含有量為98%,批號(hào)405A096);膠原酶Ⅱ(Worthington 公司,批號(hào)44N15308B);肝素鈉(Solarbio 公司,批號(hào)301A028);Glucose(Solarbio公司,批號(hào)405A096);EGTA(Fluka 公司,批號(hào)101257840);BSA(albumin from bovine serum,牛血清白蛋白,ICN 公司,批號(hào)8398F);Taurine(?;撬幔琒igma 公司,批號(hào)101282014);CsCl(Sigma 公司產(chǎn)品,批 號(hào) 101368097);TEA-Cl(Sigma 公司,批號(hào)101394223);MgATP(Sigma公司,批號(hào)1001571838);HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸,Sigma 公司,批號(hào)1001621577);TTX(Tetrodotoxin,河豚毒素,Affix 公 司,批 號(hào)AF02);其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.3 儀器 EPC-10 USB/Patchmaster 單通道膜片鉗放大器,德國(guó)Heka 公司;IX71倒置科研級(jí)顯微鏡,日本Olympus 公司;MP-225顯微操作器系統(tǒng),美國(guó)Sutter 公司;P-97微電極拉制儀,美國(guó)Sutter公司;防震臺(tái),美國(guó)TMC 公司;硼硅酸鹽玻璃電極(外徑1.5 mm,內(nèi)徑1.05 mm),武漢微探有限公司。

    2 方法

    2.1 溶液配制 臺(tái)氏液為NaCl 135 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,NaH2PO40.33 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,HEPES 5.0 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L,Glucose 10.0 mmol/L,用NaOH 調(diào)pH 為7.30~7.40;無鈣臺(tái)氏液為臺(tái)式液除去CaCl2,即可;酶溶液為無鈣臺(tái)氏液中加入0.4 g/L 膠原酶Ⅱ,1 g/L 的BSA,0.4 g/L Taurine 和30 μmol CaCl2;KB 液 為L(zhǎng)glutamic acid 70.0 mmol/L,KCl 25.0 mmol/L,Taurine 10.0 mmol/L,NaH2PO410.0 mmol/L,EGTA 0.5 mmol/L,Glucose 11.0 mmol/L,HEPES 5.0 mmol/L,KOH 89.0 mmol/L,用KOH 調(diào)pH 為7.30~7.40;電極內(nèi)液為CsCl 133.0 mmol/L,NaCl 為5.0 mmol/L,TEACl 20.0 mmol/L,EGTA 10.0 mmol/L,HEPES 10.0 mmol/L,MgATP 5.0 mmol/L,用CsOH 調(diào)pH為7.25~7.30;細(xì)胞外液為NaCl 135.0 mmol/L,CsCl 5.4 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L,HEPES 5.0 mmol/L,Glucose 10.0 mmol/L,CdCl20.1 mmol/L,用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.30~7.40。

    五味子乙素,以二甲基亞砜(DMSO)配制成100 μmol/L 的母液凍存,使用時(shí)用相應(yīng)的細(xì)胞外液分別稀釋成終濃度為1、2、3、10、30 μmol/L。

    實(shí)驗(yàn)采用自身對(duì)照,按刺激方案引導(dǎo)、記錄五味子乙素灌流前INa(對(duì)照組),待電流穩(wěn)定后分別給予不同濃度的五味子乙素灌流,并記錄INa的變化。為最大化地減小因細(xì)胞大小帶來的實(shí)驗(yàn)誤差,用電流密度表示電流值,單位pA/pF。

    2.2 大鼠心室肌細(xì)胞的分離 大鼠心室肌細(xì)胞分離參照文獻(xiàn)并略作改善[12]。大鼠麻醉,仰臥位固定,開胸暴露心臟并于降主動(dòng)脈段快速將其剪下。排出殘血、稍作修剪后迅速將主動(dòng)脈插入改良過的Langendorff 灌注架上。0.4 g/L 膠原酶Ⅱ灌流消化20~30 min,直到心臟變軟、滴速變快、流出液渾濁并有粘稠感時(shí)停止消化,整個(gè)過程保持37 ℃并持續(xù)通氧。消化結(jié)束后取下心臟剪碎,用100目濾網(wǎng)過濾得到單個(gè)心室肌細(xì)胞,充氧半小時(shí)并室溫避光放置2~3 h 后即可用于實(shí)驗(yàn)研究。

    2.3 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn) 以P-97程序化水平拉制儀制備玻璃微電極,其尖端直徑約為1.5~2 μm。入液電阻保持在2~4 MΩ,串聯(lián)電阻補(bǔ)償為30%~50%。將細(xì)胞置于細(xì)胞外液中,靜置10 min,待貼壁后續(xù)以細(xì)胞外液灌流以除去殘存的KB 液。選用狀態(tài)良好、長(zhǎng)桿狀、邊緣光滑、完整、橫紋清晰、立體感強(qiáng)、無收縮的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用PatchMaster 軟件采集引導(dǎo)出的電流,用Origin7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并結(jié)合graphpad prism6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,數(shù)據(jù)以()表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。當(dāng)膜電位保持在-80 mV,可以引導(dǎo)出一個(gè)內(nèi)向性電流,并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值。于細(xì)胞外液中加入Nav的特異性阻滯劑河豚毒素(10 μmol/L)后該電流明顯變小,用細(xì)胞外液灌流洗脫河豚毒素,此電流又得到一定程度的恢復(fù)。由此可以確定,在此刺激方案下面所引導(dǎo)出的電流即為INa,見圖1A。給予五味子乙素,觀察給藥10 min 后,圖1B 顯示,與對(duì)照組比較,3、10、30、100 μmol/L 五味子乙素對(duì)INa的作用顯著增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01),呈濃度依賴性,INa-Peak由給藥前的(-88.24 ± 6.93)pA/pF 依次降為(-77.07±6.17)、(-61.48±5.17)、(-47.78±3.69)、(-18.69±2.17)pA/pF。1、2 μmol/L 五味子乙素對(duì)INa無顯著差異,而五味子乙素在對(duì)阿霉素內(nèi)化作用時(shí),IC50為 51.50 μmol/L,100 μmol/L五味子乙素可致細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究,選擇了3、10、30 μmol/L 3個(gè)濃度。

    圖1 不同濃度的五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響(n=6)Fig.1 Effects of different concentrations of Sch B on INaof rats ventricular myocytes(n=6)

    3.2 五味子乙素對(duì)鈉通道電流-電壓關(guān)系(I-V)曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。記錄給予五味子乙素前后的INa,見圖2C,并以各刺激脈沖下引導(dǎo)出的INa電流密度(pA/pF)對(duì)應(yīng)相應(yīng)測(cè)試電壓繪制出鈉通道的I-V 曲線,見圖2A。由圖2A可見,10、30 μmol/L 五味子乙素可使鈉通道的IV 曲線顯著上移,但I(xiàn)-V 曲線的激活電位、峰電位及形態(tài)未發(fā)生改變,3 μmol/L 五味子乙素對(duì)I-V 曲線的影響不明顯。

    圖2 五味子乙素對(duì)鈉通道I-V 曲線和INa激活曲線的影響(n=6)Fig.2 Effects of Sch B on the I-V and activation curve of INa(n=6)

    3.3 五味子乙素對(duì)INa激活曲線的影響 INa的激活曲線原始數(shù)據(jù)由I-V 曲線的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化而來,并依Boltzmann 方程G/Gmax=1/ {1+exp [(V1/2-V)/k]} 進(jìn)行擬合得到穩(wěn)態(tài)激活曲線,見圖2B,縱坐標(biāo)為電導(dǎo)與最大電導(dǎo)的比值,橫坐標(biāo)為相應(yīng)的測(cè)試電壓。如圖2B 所示,3、10、30 μmol/L 五味子乙素可使激活曲線發(fā)生右移,V1/2-ac由給藥前的(-53.90±5.21)mV 分別變?yōu)椋?48.77±6.45)mV(P>0.05)、(-43.69±5.34)mV、(-40.80±3.23)mV(P<0.01),表明隨著五味子乙素濃度的增高,激活電壓相應(yīng)升高,鈉通道開啟的難度也逐漸增大。

    3.4 五味子乙素對(duì)INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。給予雙脈沖刺激,分別記錄五味子乙素給藥前后INa的穩(wěn)態(tài)失活電流(圖3B),并按Boltzmann 方程I/Imax=1/ {1 +exp [(VV1/2)/k]} 進(jìn)行擬合,繪制出INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線,見圖3A。從圖3A 可以看出,藥物可使INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線逐漸左移,表現(xiàn)為向超極化方向偏移。其中,3、10、30 μmol/L 五味子乙素使V1/2-in由給藥前的(-57.80 ± 6.21)mV 分別變?yōu)椋?64.70±7.55)mV(P>0.05)、(-71.16±6.45)mV、(-81.03±7.53)mV(P<0.01),k從給藥前(5.30±0.49)分別變?yōu)椋?.66±0.67)(P>0.05)、(7.65±0.58)、(9.19±0.62)(P<0.01)。因此,3 μmol/L五味子乙素對(duì)穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)影響不明顯,但10、30 μmol/L 五味子乙素可明顯改變INa的穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)特征,在穩(wěn)態(tài)失活狀態(tài)下通道開放靜息電位水平發(fā)生改變,加快INa的失活。

    圖3 五味子乙素對(duì)INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響(n=6)Fig.3 Effects of Sch B on the inactivation curve of INa(n=6)

    3.5 五味子乙素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。分別記錄五味子乙素給藥前后INa的失活后恢復(fù)電流,見圖4B,并通過用One-phase association 指數(shù)方程I/Imax=1-exp(-t/τ)進(jìn)行擬合,得到電流恢復(fù)曲線,縱坐標(biāo)為電流與最大電流的比值,橫坐標(biāo)為相對(duì)應(yīng)的時(shí)間,見圖4A。由圖4A 可見,3、10、30 μmol/L 五味子乙素能使INa的失活后恢復(fù)曲線逐漸右移,恢復(fù)時(shí)間常數(shù)τ由給藥前的(16.68±1.72)ms 變?yōu)椋?9.69±2.55)ms(P>0.05)、(25.73 ± 2.93)ms 和(43.79±3.87)ms(P<0.01)。可知,3 μmol/L 五味子乙素對(duì)失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)影響不明顯,但10、30 μmol/L 五味子乙素可明顯改變INa的失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征,使INa從失活態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變的時(shí)間延長(zhǎng)。

    圖4 五味子乙素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響(n=6)Fig.4 Effects of Sch B on the curve of INarecovery from inactivation(n=6)

    4 討論

    離子通道的紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),如常見的QT 綜合征、Brugada 綜合征、室性心動(dòng)過速等,此類疾病的發(fā)生都與心肌細(xì)胞上多種離子通道有關(guān)。而心肌細(xì)胞鈉離子電流為內(nèi)向電流,主要參與細(xì)胞動(dòng)作電位(AP)0相去極化過程,若鈉通道發(fā)生異常,則會(huì)使心肌細(xì)胞無法產(chǎn)生正常的AP,導(dǎo)致與鈉通道相關(guān)的離子通道疾病的發(fā)生[15]。

    膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用為更為有效的觀察鈉電流動(dòng)力學(xué)特征提供了手段。實(shí)驗(yàn)中預(yù)觀察五味子乙素對(duì)鈉電流幾種常見動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。激活曲線用來解釋通道開放水平的難易程度,若曲線發(fā)生右移則提示激活電壓升高,通道開放難度增大。穩(wěn)態(tài)失活曲線常用來解釋通道滅活的電壓依賴性及藥物對(duì)通道滅活過程的影響,若藥物使其左移則表明藥物電壓依賴性的影響通道的滅活過程,提示該藥物可能與失活態(tài)鈉通道親和力高[16]。對(duì)于失活后恢復(fù)曲線,對(duì)其進(jìn)行擬合以求得恢復(fù)時(shí)間常數(shù),時(shí)間常數(shù)越小則恢復(fù)的越快或藥物與通道分離的快,時(shí)間常數(shù)越大則分離的越慢。

    五味子已廣泛應(yīng)用于臨床,現(xiàn)已證實(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)疾病亦有療效。成分之一的五味子乙素在心血管方面的研究備受關(guān)注,然而五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的研究尚少,對(duì)鈉通道的研究也是空白。因此,本研究根據(jù)有關(guān)報(bào)道的提示[17],觀察不同濃度五味子乙素對(duì)SD 大鼠心室肌細(xì)胞INa峰值、I-V 曲線、失活和失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征的影響。結(jié)果表明,五味子乙素濃度大于3 μmol/L 能夠呈濃度依賴性地抑制INa,使I-V 曲線顯著上移,但曲線形態(tài)未發(fā)生改變,且五味子乙素在不同的膜電位水平下對(duì)INa的作用效果不同,提示五味子乙素對(duì)INa具有顯著的電壓依賴性;五味子乙素可使失活曲線顯著左移,可使恢復(fù)曲線顯著右移,進(jìn)一步加強(qiáng)了藥物對(duì)INa的抑制作用。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)五味子乙素對(duì)鈉通道的激活狀態(tài)、失活狀態(tài),恢復(fù)狀態(tài)均有作用,共同結(jié)果就是增強(qiáng)了五味子乙素對(duì)鈉通道的抑制作用。因此,推測(cè)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)的五味子乙素具有的對(duì)抗心臟毒性、I/R 損傷等作用可能與其抑制INa有關(guān)。

    此外,臨床上已將五味子用于心肌梗死、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)所致的心動(dòng)過速治療方劑中[18];古方將五味子配炙甘草湯附加苦參、仙鶴草、丹參、黃芪、龍牡等用于治療心動(dòng)過速;五味子湯加味治療心律失常[19]等效果都十分顯著。然而這其中的作用機(jī)制還不是很明確,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為解釋五味子在其中發(fā)揮作用提供部分參考價(jià)值。此外,推測(cè)心臟鈉通道功能障礙的獲得性和遺傳性疾病例如Ⅲ型長(zhǎng)QT 綜合征,心房顫動(dòng)和擴(kuò)張型心肌病等,利用五味子乙素可通過糾正鈉通道功能異常從而對(duì)患者產(chǎn)生有益效果。

    本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞鈉離子通道的作用,以此評(píng)估其對(duì)大鼠心臟電生理的影響。然而,對(duì)于其發(fā)揮心血管系統(tǒng)保護(hù)作用的具體調(diào)控機(jī)制還需要在其它通道、體內(nèi)過程及病理模型等方面做更全面的探討,為其在今后開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    肌細(xì)胞乙素失活
    燈盞乙素在抑制冠脈搭橋術(shù)后靜脈橋再狹窄中的應(yīng)用
    燈盞乙素對(duì)OX-LDL損傷的RAW264.7細(xì)胞中PKC和TNF-α表達(dá)的影響
    Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的表達(dá)
    草酸二甲酯加氫制乙二醇催化劑失活的研究
    河南科技(2015年2期)2015-02-27 14:20:35
    五味子乙素對(duì)MDR1介導(dǎo)的人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS/ADR所致多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)研究
    豚鼠乳鼠心房肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的探討*
    HPLC法測(cè)定三香健脾膠囊中延胡索乙素的含量
    冷凍脅迫下金黃色葡萄球菌的亞致死及失活規(guī)律
    缺氧易化快速起搏引起的心室肌細(xì)胞鈣瞬變交替*
    Depulpin、三聚甲醛和砷牙髓失活劑的臨床療效比較
    tube8黄色片| 91精品国产九色| 最近最新中文字幕大全电影3| av黄色大香蕉| 在线天堂最新版资源| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 色吧在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品人妻熟女av久视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久亚洲精品成人影院| 各种免费的搞黄视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久性生活片| 在线播放无遮挡| 久久热精品热| 精品一区在线观看国产| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品国产av在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美潮喷喷水| 国产乱人视频| 一级二级三级毛片免费看| 美女cb高潮喷水在线观看| 极品教师在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久热这里只有精品99| videos熟女内射| 国产v大片淫在线免费观看| 婷婷色av中文字幕| 97超碰精品成人国产| 成人毛片a级毛片在线播放| 日日撸夜夜添| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产在线一区二区三区精| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品av视频在线免费观看| 69人妻影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 听说在线观看完整版免费高清| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲在线观看片| 国产有黄有色有爽视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久国产乱子免费精品| 国产精品久久久久久av不卡| 丝袜喷水一区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一级片'在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 联通29元200g的流量卡| 亚洲精品自拍成人| 国产综合精华液| 热re99久久精品国产66热6| 91精品一卡2卡3卡4卡| 中文字幕av成人在线电影| 麻豆国产97在线/欧美| 国产 精品1| 精品视频人人做人人爽| freevideosex欧美| 欧美一区二区亚洲| 免费黄网站久久成人精品| 成人免费观看视频高清| 亚洲av.av天堂| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 99久久人妻综合| 黄色日韩在线| 亚洲自偷自拍三级| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美97在线视频| 永久网站在线| 国产视频首页在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久久久久大av| 能在线免费看毛片的网站| 国产综合懂色| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一级毛片电影观看| 91精品国产九色| 少妇高潮的动态图| 色吧在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 搞女人的毛片| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男人添女人高潮全过程视频| 91久久精品电影网| 观看美女的网站| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲色图av天堂| 国产成人91sexporn| 日韩免费高清中文字幕av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚州av有码| 在线 av 中文字幕| 人妻一区二区av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久成人免费电影| 久久午夜福利片| av在线app专区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩三级伦理在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美97在线视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 婷婷色麻豆天堂久久| 青春草亚洲视频在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99热6这里只有精品| 欧美+日韩+精品| 99热国产这里只有精品6| 一区二区三区免费毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久午夜欧美精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲成人av在线免费| 黑人高潮一二区| 水蜜桃什么品种好| 看十八女毛片水多多多| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产乱来视频区| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产自在天天线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 全区人妻精品视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成人二区视频| 两个人的视频大全免费| 91久久精品国产一区二区成人| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产视频首页在线观看| 国产久久久一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 激情五月婷婷亚洲| 99久久人妻综合| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费观看性生交大片5| av在线app专区| 22中文网久久字幕| 午夜福利视频精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲av.av天堂| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久久久大av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲欧美清纯卡通| 伦精品一区二区三区| 草草在线视频免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| 18+在线观看网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲在线观看片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 日韩一本色道免费dvd| 午夜亚洲福利在线播放| 联通29元200g的流量卡| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲四区av| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产成年人精品一区二区| 韩国av在线不卡| 白带黄色成豆腐渣| 国产视频首页在线观看| 99热这里只有是精品50| 国产一区二区在线观看日韩| 一级黄片播放器| 黄色日韩在线| 丰满乱子伦码专区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产爱豆传媒在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 人妻 亚洲 视频| 精品久久久久久久久亚洲| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美xxxx性猛交bbbb| 伦理电影大哥的女人| 国产成人精品婷婷| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产一级毛片在线| 中文天堂在线官网| 插阴视频在线观看视频| 91狼人影院| 美女国产视频在线观看| 国产成人aa在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 一级片'在线观看视频| 国产精品久久久久久久久免| 91久久精品电影网| 国产成人a∨麻豆精品| 99久久精品一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 黄色日韩在线| 观看美女的网站| 国产成人精品一,二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费观看a级毛片全部| 99久久精品国产国产毛片| 91狼人影院| 亚洲精品色激情综合| 国产精品一区www在线观看| 九草在线视频观看| av在线天堂中文字幕| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩在线观看h| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久久久久成人| 国产精品三级大全| 久久久a久久爽久久v久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 精品酒店卫生间| 男女边吃奶边做爰视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品一区www在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美国产精品一级二级三级 | 免费看av在线观看网站| 亚洲精品视频女| 能在线免费看毛片的网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久97久久精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 777米奇影视久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国精品久久久久久国模美| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲色图av天堂| 日韩强制内射视频| 联通29元200g的流量卡| 久久久久久久久大av| 一级av片app| 成人毛片60女人毛片免费| 男男h啪啪无遮挡| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av男天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 男人和女人高潮做爰伦理| 成人免费观看视频高清| av国产精品久久久久影院| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 97超碰精品成人国产| 黑人高潮一二区| 亚洲人成网站在线播| 午夜福利在线在线| 丝袜脚勾引网站| 最近中文字幕2019免费版| 观看美女的网站| 午夜免费观看性视频| 亚洲怡红院男人天堂| 国产精品久久久久久精品古装| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品日本国产第一区| 久久女婷五月综合色啪小说 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 色吧在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 深夜a级毛片| 简卡轻食公司| 91久久精品电影网| 成年人午夜在线观看视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 综合色丁香网| 高清视频免费观看一区二区| 我要看日韩黄色一级片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲内射少妇av| 真实男女啪啪啪动态图| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲av二区三区四区| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品人妻久久久久久| 大片电影免费在线观看免费| 成人美女网站在线观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 日日啪夜夜爽| 久久99热这里只有精品18| 欧美 日韩 精品 国产| 只有这里有精品99| 国产视频内射| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲国产色片| 男的添女的下面高潮视频| 国产在视频线精品| 国产高清不卡午夜福利| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品综合一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 国产成人福利小说| 欧美潮喷喷水| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人精品一,二区| 99热网站在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 视频区图区小说| 欧美3d第一页| 日本色播在线视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品无大码| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品嫩草影院av在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 能在线免费看毛片的网站| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲经典国产精华液单| 国模一区二区三区四区视频| 国产老妇女一区| 亚洲高清免费不卡视频| 在线a可以看的网站| 嫩草影院入口| 成人亚洲欧美一区二区av| 69av精品久久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美高清成人免费视频www| 一级a做视频免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 黑人高潮一二区| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av免费在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 成人国产av品久久久| 97超视频在线观看视频| tube8黄色片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 成人特级av手机在线观看| 精品视频人人做人人爽| 亚洲欧洲日产国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久影院123| 午夜免费男女啪啪视频观看| 一级二级三级毛片免费看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲最大成人av| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜福利视频精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩欧美精品免费久久| 全区人妻精品视频| 毛片女人毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产淫片久久久久久久久| 国产午夜福利久久久久久| 一本一本综合久久| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品夜色国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩中字成人| av黄色大香蕉| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕久久专区| 久久ye,这里只有精品| 免费看不卡的av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲在久久综合| 国精品久久久久久国模美| 亚洲色图av天堂| 欧美成人一区二区免费高清观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男人和女人高潮做爰伦理| 两个人的视频大全免费| 国产成人aa在线观看| freevideosex欧美| 欧美成人精品欧美一级黄| 日韩精品有码人妻一区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一本色道久久久久久精品综合| 天堂网av新在线| 色哟哟·www| 少妇的逼水好多| 亚洲最大成人av| 欧美激情国产日韩精品一区| av卡一久久| 全区人妻精品视频| 熟女人妻精品中文字幕| av在线观看视频网站免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 99久久精品热视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 日本黄大片高清| 老司机影院成人| 久久热精品热| 嘟嘟电影网在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 成人二区视频| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品第二区| 久久国产乱子免费精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美日本视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇 在线观看| 国产精品无大码| 亚洲不卡免费看| 免费电影在线观看免费观看| av专区在线播放| 中国国产av一级| 岛国毛片在线播放| 大香蕉97超碰在线| 久久久精品94久久精品| 成年免费大片在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国国产精品蜜臀av免费| 精品久久久噜噜| 精品人妻视频免费看| 人妻系列 视频| 制服丝袜香蕉在线| 欧美激情在线99| 中国美白少妇内射xxxbb| 一级毛片 在线播放| 国产乱来视频区| 午夜日本视频在线| 国产在视频线精品| 身体一侧抽搐| 韩国高清视频一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 精品一区在线观看国产| 九草在线视频观看| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 波多野结衣巨乳人妻| 免费观看性生交大片5| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 丝袜脚勾引网站| 成人黄色视频免费在线看| 日日啪夜夜爽| av一本久久久久| 大香蕉久久网| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲欧美精品专区久久| 国产乱人偷精品视频| 精品久久国产蜜桃| 九草在线视频观看| 老司机影院成人| 亚洲欧美精品专区久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产成人精品福利久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 国产在线一区二区三区精| 麻豆国产97在线/欧美| 日本熟妇午夜| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产黄频视频在线观看| videos熟女内射| 国产精品爽爽va在线观看网站| 女人久久www免费人成看片| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲精品,欧美精品| 国产在线一区二区三区精| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品一二三区在线看| 亚洲伊人久久精品综合| 波多野结衣巨乳人妻| 国产免费视频播放在线视频| 中文天堂在线官网| 国产91av在线免费观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 久久久久网色| 少妇人妻一区二区三区视频| 99热这里只有是精品50| 综合色丁香网| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 51国产日韩欧美| 久久久久精品久久久久真实原创| av专区在线播放| 69av精品久久久久久| 永久免费av网站大全| 女人被狂操c到高潮| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美成人一区二区免费高清观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久久久久久久丰满| av一本久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产精品偷伦视频观看了| 中文在线观看免费www的网站| 中国国产av一级| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产乱人视频| 99久久人妻综合| 精品一区在线观看国产| 国产老妇女一区| 久久99热6这里只有精品| 日韩大片免费观看网站| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲最大成人手机在线| av国产免费在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产高清国产精品国产三级 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 麻豆成人av视频| 亚洲最大成人手机在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 联通29元200g的流量卡| 毛片一级片免费看久久久久| 久久精品人妻少妇| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产免费福利视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产黄片美女视频| 久久人人爽人人片av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 街头女战士在线观看网站| 黄色欧美视频在线观看| 丝袜美腿在线中文| 久久精品人妻少妇| 观看免费一级毛片| 久久99热这里只频精品6学生| 成人毛片a级毛片在线播放| 直男gayav资源| 国产综合精华液| 午夜福利网站1000一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 激情 狠狠 欧美| 高清午夜精品一区二区三区| 极品教师在线视频| 国产精品三级大全| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲成人一二三区av| 国产亚洲91精品色在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲精品第二区| 亚州av有码| 女人久久www免费人成看片| 久久久久性生活片| 亚州av有码| 白带黄色成豆腐渣| 久久99热6这里只有精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产黄片美女视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产亚洲91精品色在线| 欧美最新免费一区二区三区| 成人二区视频| 久久久久久国产a免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 成人二区视频| 一级毛片电影观看| 成年女人看的毛片在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 成人一区二区视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 日本色播在线视频|