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    五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的影響

    2019-11-21 06:03:54麗王秀秀錢薇楊蘊(yùn)智葛焱許正新
    中成藥 2019年11期
    關(guān)鍵詞:肌細(xì)胞乙素失活

    鄒 麗王秀秀錢 薇楊蘊(yùn)智葛 焱許正新

    (1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225000;2.江蘇省重點(diǎn)動(dòng)物傳染病和人畜共患病預(yù)防控制共創(chuàng)中心,江蘇 揚(yáng)州225001;3.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州225001;4.江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州225009)

    五味子,木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí),性味酸甘溫,具有寧心安神的功效,主治心神失養(yǎng)之虛煩心悸,失眠多夢(mèng)等癥狀。傳統(tǒng)中藥五味子以顯著的保肝作用而廣泛應(yīng)用于臨床[1-2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),五味子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3]、心腦血管系統(tǒng)[4-5]、免疫系統(tǒng)[6]亦有良好作用。劉菊秀等[7]的研究結(jié)果提示,適當(dāng)劑量的五味子具有減弱心收縮力,減慢心率的作用。成分分析結(jié)果顯示,五味子含揮發(fā)性成分、木脂素和有機(jī)酸等[8]。其中,屬于聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素類的五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)具有許多有應(yīng)用前景的藥理作用[9]。胡開永等[10]報(bào)道,五味子乙素對(duì)阿霉素引起的心肌毒性具有保護(hù)作用;孫紅霞等[11]研究發(fā)現(xiàn),五味子乙素對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注(I/R)損傷具有一定保護(hù)作用。眾所周知,藥物引起的心臟毒性、心臟缺血再灌注損傷等一系列作用的產(chǎn)生與離子通道密切相關(guān),因此探索五味子乙素與離子通道之間的關(guān)系具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),探究五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞除極相的主要通道電流—鈉離子通道電流(INa)的影響。闡述五味子乙素與鈉通道有無關(guān)聯(lián),并為其今后的開發(fā)利用及更好地服務(wù)于臨床提供理論依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 SD 大鼠(250±20)g,雌雄不拘,揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供 [SCXK(蘇)2017-0044]。

    1.2 試藥 五味子乙素(成都埃爾法生物科技有限公司,含有量為98%,批號(hào)405A096);膠原酶Ⅱ(Worthington 公司,批號(hào)44N15308B);肝素鈉(Solarbio 公司,批號(hào)301A028);Glucose(Solarbio公司,批號(hào)405A096);EGTA(Fluka 公司,批號(hào)101257840);BSA(albumin from bovine serum,牛血清白蛋白,ICN 公司,批號(hào)8398F);Taurine(?;撬幔琒igma 公司,批號(hào)101282014);CsCl(Sigma 公司產(chǎn)品,批 號(hào) 101368097);TEA-Cl(Sigma 公司,批號(hào)101394223);MgATP(Sigma公司,批號(hào)1001571838);HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸,Sigma 公司,批號(hào)1001621577);TTX(Tetrodotoxin,河豚毒素,Affix 公 司,批 號(hào)AF02);其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.3 儀器 EPC-10 USB/Patchmaster 單通道膜片鉗放大器,德國(guó)Heka 公司;IX71倒置科研級(jí)顯微鏡,日本Olympus 公司;MP-225顯微操作器系統(tǒng),美國(guó)Sutter 公司;P-97微電極拉制儀,美國(guó)Sutter公司;防震臺(tái),美國(guó)TMC 公司;硼硅酸鹽玻璃電極(外徑1.5 mm,內(nèi)徑1.05 mm),武漢微探有限公司。

    2 方法

    2.1 溶液配制 臺(tái)氏液為NaCl 135 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,NaH2PO40.33 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,HEPES 5.0 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L,Glucose 10.0 mmol/L,用NaOH 調(diào)pH 為7.30~7.40;無鈣臺(tái)氏液為臺(tái)式液除去CaCl2,即可;酶溶液為無鈣臺(tái)氏液中加入0.4 g/L 膠原酶Ⅱ,1 g/L 的BSA,0.4 g/L Taurine 和30 μmol CaCl2;KB 液 為L(zhǎng)glutamic acid 70.0 mmol/L,KCl 25.0 mmol/L,Taurine 10.0 mmol/L,NaH2PO410.0 mmol/L,EGTA 0.5 mmol/L,Glucose 11.0 mmol/L,HEPES 5.0 mmol/L,KOH 89.0 mmol/L,用KOH 調(diào)pH 為7.30~7.40;電極內(nèi)液為CsCl 133.0 mmol/L,NaCl 為5.0 mmol/L,TEACl 20.0 mmol/L,EGTA 10.0 mmol/L,HEPES 10.0 mmol/L,MgATP 5.0 mmol/L,用CsOH 調(diào)pH為7.25~7.30;細(xì)胞外液為NaCl 135.0 mmol/L,CsCl 5.4 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L,HEPES 5.0 mmol/L,Glucose 10.0 mmol/L,CdCl20.1 mmol/L,用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.30~7.40。

    五味子乙素,以二甲基亞砜(DMSO)配制成100 μmol/L 的母液凍存,使用時(shí)用相應(yīng)的細(xì)胞外液分別稀釋成終濃度為1、2、3、10、30 μmol/L。

    實(shí)驗(yàn)采用自身對(duì)照,按刺激方案引導(dǎo)、記錄五味子乙素灌流前INa(對(duì)照組),待電流穩(wěn)定后分別給予不同濃度的五味子乙素灌流,并記錄INa的變化。為最大化地減小因細(xì)胞大小帶來的實(shí)驗(yàn)誤差,用電流密度表示電流值,單位pA/pF。

    2.2 大鼠心室肌細(xì)胞的分離 大鼠心室肌細(xì)胞分離參照文獻(xiàn)并略作改善[12]。大鼠麻醉,仰臥位固定,開胸暴露心臟并于降主動(dòng)脈段快速將其剪下。排出殘血、稍作修剪后迅速將主動(dòng)脈插入改良過的Langendorff 灌注架上。0.4 g/L 膠原酶Ⅱ灌流消化20~30 min,直到心臟變軟、滴速變快、流出液渾濁并有粘稠感時(shí)停止消化,整個(gè)過程保持37 ℃并持續(xù)通氧。消化結(jié)束后取下心臟剪碎,用100目濾網(wǎng)過濾得到單個(gè)心室肌細(xì)胞,充氧半小時(shí)并室溫避光放置2~3 h 后即可用于實(shí)驗(yàn)研究。

    2.3 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn) 以P-97程序化水平拉制儀制備玻璃微電極,其尖端直徑約為1.5~2 μm。入液電阻保持在2~4 MΩ,串聯(lián)電阻補(bǔ)償為30%~50%。將細(xì)胞置于細(xì)胞外液中,靜置10 min,待貼壁后續(xù)以細(xì)胞外液灌流以除去殘存的KB 液。選用狀態(tài)良好、長(zhǎng)桿狀、邊緣光滑、完整、橫紋清晰、立體感強(qiáng)、無收縮的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用PatchMaster 軟件采集引導(dǎo)出的電流,用Origin7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并結(jié)合graphpad prism6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,數(shù)據(jù)以()表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。當(dāng)膜電位保持在-80 mV,可以引導(dǎo)出一個(gè)內(nèi)向性電流,并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大值。于細(xì)胞外液中加入Nav的特異性阻滯劑河豚毒素(10 μmol/L)后該電流明顯變小,用細(xì)胞外液灌流洗脫河豚毒素,此電流又得到一定程度的恢復(fù)。由此可以確定,在此刺激方案下面所引導(dǎo)出的電流即為INa,見圖1A。給予五味子乙素,觀察給藥10 min 后,圖1B 顯示,與對(duì)照組比較,3、10、30、100 μmol/L 五味子乙素對(duì)INa的作用顯著增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01),呈濃度依賴性,INa-Peak由給藥前的(-88.24 ± 6.93)pA/pF 依次降為(-77.07±6.17)、(-61.48±5.17)、(-47.78±3.69)、(-18.69±2.17)pA/pF。1、2 μmol/L 五味子乙素對(duì)INa無顯著差異,而五味子乙素在對(duì)阿霉素內(nèi)化作用時(shí),IC50為 51.50 μmol/L,100 μmol/L五味子乙素可致細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究,選擇了3、10、30 μmol/L 3個(gè)濃度。

    圖1 不同濃度的五味子乙素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響(n=6)Fig.1 Effects of different concentrations of Sch B on INaof rats ventricular myocytes(n=6)

    3.2 五味子乙素對(duì)鈉通道電流-電壓關(guān)系(I-V)曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。記錄給予五味子乙素前后的INa,見圖2C,并以各刺激脈沖下引導(dǎo)出的INa電流密度(pA/pF)對(duì)應(yīng)相應(yīng)測(cè)試電壓繪制出鈉通道的I-V 曲線,見圖2A。由圖2A可見,10、30 μmol/L 五味子乙素可使鈉通道的IV 曲線顯著上移,但I(xiàn)-V 曲線的激活電位、峰電位及形態(tài)未發(fā)生改變,3 μmol/L 五味子乙素對(duì)I-V 曲線的影響不明顯。

    圖2 五味子乙素對(duì)鈉通道I-V 曲線和INa激活曲線的影響(n=6)Fig.2 Effects of Sch B on the I-V and activation curve of INa(n=6)

    3.3 五味子乙素對(duì)INa激活曲線的影響 INa的激活曲線原始數(shù)據(jù)由I-V 曲線的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化而來,并依Boltzmann 方程G/Gmax=1/ {1+exp [(V1/2-V)/k]} 進(jìn)行擬合得到穩(wěn)態(tài)激活曲線,見圖2B,縱坐標(biāo)為電導(dǎo)與最大電導(dǎo)的比值,橫坐標(biāo)為相應(yīng)的測(cè)試電壓。如圖2B 所示,3、10、30 μmol/L 五味子乙素可使激活曲線發(fā)生右移,V1/2-ac由給藥前的(-53.90±5.21)mV 分別變?yōu)椋?48.77±6.45)mV(P>0.05)、(-43.69±5.34)mV、(-40.80±3.23)mV(P<0.01),表明隨著五味子乙素濃度的增高,激活電壓相應(yīng)升高,鈉通道開啟的難度也逐漸增大。

    3.4 五味子乙素對(duì)INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。給予雙脈沖刺激,分別記錄五味子乙素給藥前后INa的穩(wěn)態(tài)失活電流(圖3B),并按Boltzmann 方程I/Imax=1/ {1 +exp [(VV1/2)/k]} 進(jìn)行擬合,繪制出INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線,見圖3A。從圖3A 可以看出,藥物可使INa的穩(wěn)態(tài)失活曲線逐漸左移,表現(xiàn)為向超極化方向偏移。其中,3、10、30 μmol/L 五味子乙素使V1/2-in由給藥前的(-57.80 ± 6.21)mV 分別變?yōu)椋?64.70±7.55)mV(P>0.05)、(-71.16±6.45)mV、(-81.03±7.53)mV(P<0.01),k從給藥前(5.30±0.49)分別變?yōu)椋?.66±0.67)(P>0.05)、(7.65±0.58)、(9.19±0.62)(P<0.01)。因此,3 μmol/L五味子乙素對(duì)穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)影響不明顯,但10、30 μmol/L 五味子乙素可明顯改變INa的穩(wěn)態(tài)失活動(dòng)力學(xué)特征,在穩(wěn)態(tài)失活狀態(tài)下通道開放靜息電位水平發(fā)生改變,加快INa的失活。

    圖3 五味子乙素對(duì)INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響(n=6)Fig.3 Effects of Sch B on the inactivation curve of INa(n=6)

    3.5 五味子乙素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響 刺激方案參考文獻(xiàn)[13]。分別記錄五味子乙素給藥前后INa的失活后恢復(fù)電流,見圖4B,并通過用One-phase association 指數(shù)方程I/Imax=1-exp(-t/τ)進(jìn)行擬合,得到電流恢復(fù)曲線,縱坐標(biāo)為電流與最大電流的比值,橫坐標(biāo)為相對(duì)應(yīng)的時(shí)間,見圖4A。由圖4A 可見,3、10、30 μmol/L 五味子乙素能使INa的失活后恢復(fù)曲線逐漸右移,恢復(fù)時(shí)間常數(shù)τ由給藥前的(16.68±1.72)ms 變?yōu)椋?9.69±2.55)ms(P>0.05)、(25.73 ± 2.93)ms 和(43.79±3.87)ms(P<0.01)。可知,3 μmol/L 五味子乙素對(duì)失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)影響不明顯,但10、30 μmol/L 五味子乙素可明顯改變INa的失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征,使INa從失活態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變的時(shí)間延長(zhǎng)。

    圖4 五味子乙素對(duì)INa失活后恢復(fù)曲線的影響(n=6)Fig.4 Effects of Sch B on the curve of INarecovery from inactivation(n=6)

    4 討論

    離子通道的紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),如常見的QT 綜合征、Brugada 綜合征、室性心動(dòng)過速等,此類疾病的發(fā)生都與心肌細(xì)胞上多種離子通道有關(guān)。而心肌細(xì)胞鈉離子電流為內(nèi)向電流,主要參與細(xì)胞動(dòng)作電位(AP)0相去極化過程,若鈉通道發(fā)生異常,則會(huì)使心肌細(xì)胞無法產(chǎn)生正常的AP,導(dǎo)致與鈉通道相關(guān)的離子通道疾病的發(fā)生[15]。

    膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用為更為有效的觀察鈉電流動(dòng)力學(xué)特征提供了手段。實(shí)驗(yàn)中預(yù)觀察五味子乙素對(duì)鈉電流幾種常見動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。激活曲線用來解釋通道開放水平的難易程度,若曲線發(fā)生右移則提示激活電壓升高,通道開放難度增大。穩(wěn)態(tài)失活曲線常用來解釋通道滅活的電壓依賴性及藥物對(duì)通道滅活過程的影響,若藥物使其左移則表明藥物電壓依賴性的影響通道的滅活過程,提示該藥物可能與失活態(tài)鈉通道親和力高[16]。對(duì)于失活后恢復(fù)曲線,對(duì)其進(jìn)行擬合以求得恢復(fù)時(shí)間常數(shù),時(shí)間常數(shù)越小則恢復(fù)的越快或藥物與通道分離的快,時(shí)間常數(shù)越大則分離的越慢。

    五味子已廣泛應(yīng)用于臨床,現(xiàn)已證實(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)疾病亦有療效。成分之一的五味子乙素在心血管方面的研究備受關(guān)注,然而五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞離子通道的研究尚少,對(duì)鈉通道的研究也是空白。因此,本研究根據(jù)有關(guān)報(bào)道的提示[17],觀察不同濃度五味子乙素對(duì)SD 大鼠心室肌細(xì)胞INa峰值、I-V 曲線、失活和失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)特征的影響。結(jié)果表明,五味子乙素濃度大于3 μmol/L 能夠呈濃度依賴性地抑制INa,使I-V 曲線顯著上移,但曲線形態(tài)未發(fā)生改變,且五味子乙素在不同的膜電位水平下對(duì)INa的作用效果不同,提示五味子乙素對(duì)INa具有顯著的電壓依賴性;五味子乙素可使失活曲線顯著左移,可使恢復(fù)曲線顯著右移,進(jìn)一步加強(qiáng)了藥物對(duì)INa的抑制作用。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)五味子乙素對(duì)鈉通道的激活狀態(tài)、失活狀態(tài),恢復(fù)狀態(tài)均有作用,共同結(jié)果就是增強(qiáng)了五味子乙素對(duì)鈉通道的抑制作用。因此,推測(cè)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)的五味子乙素具有的對(duì)抗心臟毒性、I/R 損傷等作用可能與其抑制INa有關(guān)。

    此外,臨床上已將五味子用于心肌梗死、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)所致的心動(dòng)過速治療方劑中[18];古方將五味子配炙甘草湯附加苦參、仙鶴草、丹參、黃芪、龍牡等用于治療心動(dòng)過速;五味子湯加味治療心律失常[19]等效果都十分顯著。然而這其中的作用機(jī)制還不是很明確,而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為解釋五味子在其中發(fā)揮作用提供部分參考價(jià)值。此外,推測(cè)心臟鈉通道功能障礙的獲得性和遺傳性疾病例如Ⅲ型長(zhǎng)QT 綜合征,心房顫動(dòng)和擴(kuò)張型心肌病等,利用五味子乙素可通過糾正鈉通道功能異常從而對(duì)患者產(chǎn)生有益效果。

    本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究五味子乙素對(duì)心肌細(xì)胞鈉離子通道的作用,以此評(píng)估其對(duì)大鼠心臟電生理的影響。然而,對(duì)于其發(fā)揮心血管系統(tǒng)保護(hù)作用的具體調(diào)控機(jī)制還需要在其它通道、體內(nèi)過程及病理模型等方面做更全面的探討,為其在今后開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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