果糖通過激活Akt信號通路促進3T3-L1細胞的脂肪分化*

李穎霞， 姜利彬， 徐海燕， 樊周沛， 何益信， 溫洪濤

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 河南 鄭州 450000)

果糖(fructose)是與葡萄糖同分異構(gòu)的單糖；近幾十年來，基于果糖具有血糖生成指數(shù)較低及高甜度等優(yōu)點，居民以蔗糖和高果糖玉米糖漿這2種方式攝取的果糖的量正在逐年增加[1-2]。在人體中，果糖主要在肝臟中代謝為果糖-1-磷酸，隨后以磷酸二羥丙酮和磷酸甘油醛的形式進入糖酵解、脂質(zhì)合成和糖異生等循環(huán)過程[3]。越來越多的實驗研究證明，攝入過多的果糖能顯著增加體重，促進內(nèi)臟肥胖、血脂異常和胰島素抵抗等代謝綜合征的發(fā)生風險[4-6]。然而，高果糖攝入是如何引起病理改變的分子機制尚不清楚。

肥胖是許多疾病，如糖尿病的明確危險因素。當前體脂肪細胞增殖和分化異常增多時，會引起體內(nèi)脂肪組織過多的積累和內(nèi)分泌紊亂，繼而引發(fā)糖尿病和高血壓等疾病[7-9]。由此可見，研究前體脂肪細胞的增殖和分化過程有助于我們了解疾病的分子機制，同時，在臨床上適度抑制前體脂肪細胞分化可以達到預防及改善疾病的效果，對于研究預防和治療肥胖及代謝性疾病具有重大的意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)[10-11]和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)是目前已知的調(diào)節(jié)前體脂肪細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子[12]，它們能夠促進下游脂質(zhì)積累及脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶，如脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4;又稱脂肪細胞蛋白2，adipocyte protein 2, aP2)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthesis，F(xiàn)AS)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)等的表達[13]，對于調(diào)控前體脂肪細胞的分化是十分重要的。Zubiría等[14]在正常成年雄性大鼠的飲水中加入含有10% (W/V)果糖的食物(fructose-rich diet，F(xiàn)RD)，并評估內(nèi)臟脂肪組織(visceral adipose tissue，VAT)墊體積變化及分離的基質(zhì)-血管段(stromal-vascular fraction，SVF)前體脂肪分化及增殖情況，在流式細胞學方法證實VAT前體細胞群數(shù)量在各組之間沒有差異的情況下，連續(xù)喂養(yǎng)3周后發(fā)現(xiàn)，給予果糖喂養(yǎng)的大鼠血漿中胰島素、甘油三酯和瘦素的水平顯著增加，同時來源于腹膜后脂肪組織(retroperitoneal adipose tissue，RPAT)脂肪前體細胞(adipocyte precursor cells，APCs)中Zpf423和PPARγ2的表達水平顯著增加；飼養(yǎng)8周后，RPAT質(zhì)量增加和APCs體積增大[15]，表明果糖對前體脂肪細胞的增殖和分化具有直接影響。

研究表明胰島素誘導的Akt信號通路是脂肪分化過程中的核心信號通路[16-17]。鑒于果糖和肥胖之間的潛在聯(lián)系，且果糖在體外如何調(diào)控前體脂肪細胞分化尚不清楚，我們對3T3-L1細胞模型進行果糖誘導，通過油紅O染色、RT-qPCR和Western blot實驗檢測前體脂肪細胞分化期間相關(guān)基因及蛋白的表達變化，進一步闡明果糖對3T3-L1前脂肪細胞分化過程的影響及具體作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞株 3T3-L1細胞系購自ATCC細胞庫(ATCC?CL-173TM)。

1.2試劑 果糖(Sigma-Aldrich，CAS：108311-21-3)；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基(葡萄糖4.5 g/L)及優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Gibco)；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和II 抗(上海碧云天)；抗PPARγ(# 2435)、aP2(# K1708)、p-Akt(# 4060P)和Akt(# 9272)抗體(Cell Signaling Technology)；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、油紅O、抗β-肌動蛋白抗體、地塞米松、Akt特異性阻斷劑LY294002(# L9908)及胰島素(Sigma)；實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)；TRIzol試劑(Life Technology)。

2 方法

2.13T3-L1細胞的培養(yǎng)并誘導分化 在37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)3T3-L1細胞，并將細胞分成空白對照(control)組、誘導分化(differentiation medium，DM)組以及誘導分化+果糖處理組(DM+fructose組)，處理組果糖的終濃度是1 g/L。細胞以1×109/L密度接種于6孔板上，待細胞100%融合并接觸抑制2 d，利用經(jīng)典雞尾酒方法[18]進行誘導分化：含有0.5 mmol/L IBMX、1.0 μmol/L地塞米松、1 mg/L胰島素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 d，隨后換成含1 mg/L胰島素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)液1次，直到分化成熟。

2.2油紅O染色及定量 PBS洗滌細胞3次后，在室溫條件下用4%多聚甲醛固定30 min，再次用PBS洗滌3次并干燥。加入油紅O工作液室溫孵育30 min，雙蒸水沖洗2次后用顯微鏡觀察。為了量化細胞內(nèi)脂質(zhì)含量，用等量的100%異丙醇進行油紅O萃取，最后在波長510 nm處測量吸光度(A)值。

2.3RT-qPCR 根據(jù)TRIzol試劑提取誘導分化的細胞總RNA。具體操作方法基于TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明。使用小鼠GAPDH作為內(nèi)參照，并使用cDNA的第1鏈為作為模板，通過real-time PCR檢測基因表達。引物序列見表1。大致反應(yīng)程序為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s、64 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。

2.4Western blot 實驗 當接種后的3T3-L1細胞培

表1 RT-qPCR實驗的引物序列

Plin2: perilipin-2.

養(yǎng)至80%覆蓋時，通過上訴方法誘導分化。加入裂解緩沖液，4 ℃靜置30 min, 超聲破碎30 s，12 000×g離心20 min，取上清。通過SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%的脫脂牛奶(用含0.1% Tween-20的PBST稀釋)封閉1.5 h，加入抗PPARγ、aP2、p-Akt和Akt抗體，在4 ℃過夜后，PBST沖洗3次，加入第 II 抗體，在室溫下孵育1 h，再用PBST漂洗3次。用顯影劑將PVDF膜著色并曝光到X射線膠片上，用ImageJ 1.48軟件進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式呈現(xiàn)，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 果糖促進3T3-L1前脂肪細胞分化

為探究果糖對3T3-L1細胞脂肪分化過程的調(diào)控作用，在誘導分化的3T3-L1細胞中加入1 g/L果糖進行干預，收獲自誘導分化開始后3 d的細胞。Western blot分析3T3-L1細胞中分化標志蛋白PPARγ和aP2的表達水平，結(jié)果顯示，與DM組比較，DM+fructose組細胞內(nèi)的PPARγ和aP2蛋白表達水平在第3天顯著上調(diào)(P<0.01),見圖1A。

油紅O染色結(jié)果顯示，DM+fructose組中脂肪細胞的體積增加，脂滴在胞質(zhì)內(nèi)的積累量也明顯增加;定量發(fā)現(xiàn)DM+fructose組中脂質(zhì)的積累量顯著增加(P<0.01)，見圖1B。同時，RT-qPCR結(jié)果顯示，DM+fructose組中，細胞內(nèi)Plin2的mRNA表達水平上調(diào)32%(P<0.01)，C/EBPα的mRNA表達水平上調(diào)15%(P<0.01)，C/EBPβ的mRNA表達水平上調(diào)23%(P<0.05)，見圖1C。以上實驗結(jié)果提示果糖對3T3-L1細胞的脂肪分化具有促進作用。

2 果糖激活3T3-L1前脂肪細胞的Akt信號通路

許多研究已經(jīng)證實，Akt信號通路在脂肪分化中起著重要作用[19]。我們預先利用果糖處理細胞30 min，Western blot檢測p-Akt和Akt的蛋白水平變化，觀察果糖對細胞Akt信號通路的影響。結(jié)果顯示,實驗(DM+fructose)組的細胞中p-Akt水平比對照組顯著增加(P<0.01)，而使用Akt的特異性阻斷劑LY294002(10 μmol/L)預先處理1 h后，Akt的磷酸化被抑制，恢復至本底水平(P<0.01),見圖2。這提示果糖能快速激活3T3-L1細胞的Akt信號通路。

3 果糖通過Akt信號通路促進3T3-L1脂肪分化

分析以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，果糖可激活脂肪細胞中的Akt信號通路，但具體調(diào)控細節(jié)尚不可知。因此，我們加入Akt的特異性阻斷劑 LY294002，來觀察果糖是如何影響 3T3-L1前脂肪細胞的分化。利用 LY294002(10 μmol/L)預先處理細胞 1 h，再將DM組和DM+Fructose組中的3T3-L1細胞進行誘導分化。結(jié)果顯示，使用 LY294002 阻斷Akt通路后，脂肪分化的細胞標志物PPARγ和aP2的誘導表達恢復至本底水平(P<0.01)，見圖3A;同時，油紅O染色結(jié)果顯示，誘導細胞(DM+fructose組)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)積累和形成脂肪滴，而實驗組(DM+fructose+LY294002組)幾乎沒有脂肪細胞形成，見圖3B，證實Akt 信號通路在脂肪分化中起主導作用。該結(jié)果提示，果糖對Akt信號通路的活化與其對3T3-L1脂肪分化的促進作用可能直接相關(guān)，并呈正性調(diào)控作用。

討 論

盡管已有臨床數(shù)據(jù)證實，果糖較葡萄糖更能促進肥胖并且降低肥胖患者體內(nèi)的胰島素敏感性[20]。在同等高濃度1～4.5 g/L狀態(tài)下，果糖的運輸量遠高于葡萄糖。而在低濃度0.1 g/L時，果糖可以比葡萄糖更加有效地被吸收，與低濃度果糖依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運體5(glucose transporter type 5，GLUT5)的刺激作用有關(guān)[21]。但是果糖對于脂肪分化形成及脂質(zhì)代謝的作用機制尚未明確。攝入的果糖中約50%～60%在肝臟代謝，20%在腎臟中代謝，其余部分到達外周組織，如脂肪中[22]。由于果糖的代謝不受果糖-1,6-二磷酸酶的限制，因此肝臟中只有一小部分果糖轉(zhuǎn)化為糖原或者乳酸，大部分果糖都會進入脂質(zhì)新生的代謝途徑中[23]，進而再次循環(huán)代謝產(chǎn)生大量的甘油三酯和膽固醇。

Figure 1.Fructose promoted adipose differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. A: the protein expression of PPARγ and aP2 in the 3T3-L1 cells after treated with fructose at 1 g/L for 3 d; B: the differentiation process of the 3T3-L1 cells after adding 1 g/L fructose for 14 d (oil red O staining, the scale bar=100 μm; isopropanol was used to extract oil red O and the absorbance of 510 nm was detected); C: RT-qPCR was used to detect the relative mRNA expression levels of Plin2, C/EBPα and C/EBPβ in the 3T3-L1 cells after adding fructose at 1 g/L for 3 d to induce adipose differentiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group or DM group.

圖1 果糖促進3T3-L1細胞的脂肪分化

Figure 2.Fructose activated Akt signaling pathway in the 3T3-L1 preadipocytes. The 3T3-L1 cells were treated with 1 g/L fructose or 1 g/L fructose+10 μmol/L LY294002 for 30 min, and the protein level of p-Akt was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group or DM group;##P<0.01vsDM+fructose group.

圖2 果糖激活3T3-L1細胞中的Akt信號通路

Figure 3.Fructose promoted adipose differentiation of 3T3-L1 cells through Akt signaling pathway. A: the protein levels of PPARγ and aP2 were determined by Western blot; B: the differentiation process of the 3T3-L1 cells (oil red O staining, the scale bar=100 μm; isopropanol was used to extract oil red O and the absorbance of 510 nm was detected). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group or DM group;##P<0.01vsDM+fructose group.

圖3 果糖通過激活Akt信號途徑促進3T3-L1細胞的脂肪分化

脂肪前體細胞可在促脂肪生成信號刺激下向脂肪細胞分化，獲得對胰島素的敏感性，促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。本研究中，我們研究了果糖對3T3-L1細胞脂肪分化的影響及Akt信號通路在3T3-L1前體脂肪細胞分化中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)果糖促進3T3-L1前體脂肪細胞分化，這種作用可能是通正性調(diào)節(jié)Akt信號通路來實現(xiàn)，提示果糖可能是治療疾病的新靶點，對于肥胖發(fā)病機制的探究也具有一定的理論意義。但本實驗基于體外環(huán)境的細胞實驗，較高的果糖濃度在正常生理條件下是不存在的。因此，未來需要借助更加完善和深入的臨床實驗來佐證當前研究結(jié)果。

3T3-L1細胞可高效利用果糖。在本研究中，我們對誘導分化的脂肪細胞進行油紅O染色及定量研究，發(fā)現(xiàn)DM+fructose組中細胞內(nèi)脂滴明顯多于空白對照組和DM組。CEBPs和PPARγ是調(diào)控如ACC、FAS、aP2和GLUT4等靶基因的重要轉(zhuǎn)錄因子[24]。為了進一步探討果糖促進脂肪細胞分化的可能機制，本實驗對分化的早期標志物C/EBPα、C/EBPβ和Plin2的mRNA進行RT-qPCR驗證及PPARγ和aP2的蛋白表達量改變進行檢測。實驗證明給予1 g/L的果糖干預可以顯著上調(diào)脂肪細胞C/EBPα、C/EBPβ和Plin2的mRNA與PPARγ和aP2蛋白的表達。

Akt信號途徑在胰島素的靶組織中發(fā)揮傳導信號、促進組織對糖的攝取，維持正常的糖代謝和脂肪組織形成中起重要作用[25]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Akt是參與調(diào)控脂肪定向分化的信號通路，果糖能快速激活3T3-L1細胞的Akt信號通路。在以往研究中，Yang等[26]發(fā)現(xiàn)當PI3K-Akt信號通路被抑制之后，間充質(zhì)干細胞會出現(xiàn)胰島素耐受和脂肪分化會受到影響。胰島素和其信號通路下游分子IRS-1、PI3K-Akt以及CREB都是脂肪分化的關(guān)鍵調(diào)控因子[27-28]，進一步佐證了本實驗的研究結(jié)果。

總之，本研究在體外環(huán)境中證實果糖正性調(diào)控3T3-L1脂肪細胞的分化，并可能是通過激活Akt信號通路發(fā)揮促進作用。這為闡明特定病理生理條件下果糖的生物學效應(yīng)和作用機制奠定了基礎(chǔ)，也為由肥胖及相關(guān)并發(fā)癥的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。此外，本研究所使用的誘導分化培養(yǎng)基目的是激活和誘導3T3-L1的脂肪分化，研究中使用的果糖同樣也具有該功能，因此果糖和DM之間是否會存在一定的聯(lián)合作用或者協(xié)同作用，將會在今后的研究中深入探究。