轉(zhuǎn)錄因子NtMYC2b參與煙草煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)形成的機(jī)制研究

吳宇瑤，謝 瑞，楊友成，劉坤華，聶 瓊

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學(xué) 貴州省煙草品種研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 3.遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，貴州 遵義563000； 4.遵義市煙草公司，貴州 遵義 563000)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)又名反式作用因子，是一種行使調(diào)控基因表達(dá)功能且具有特殊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，能特異性地識(shí)別并結(jié)合順式元件啟動(dòng)子區(qū)域的核心序列，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控過程是植物信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，廣泛參與植物初生和次生代謝產(chǎn)物合成[3-4]等各種生物學(xué)過程，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。目前，植物中已經(jīng)鑒定出的轉(zhuǎn)錄因子有多種[5-7]，其中MYC2屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，在茉莉酸(JA)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中處于核心地位，發(fā)揮著重要作用[8]。ZHANG等[9]在煙草中克隆得到2個(gè)MYC2基因，命名為NtMYC2a和NtMYC2b，研究發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因影響尼古丁的合成，在體外也能特異性結(jié)合煙堿合成關(guān)鍵酶N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(PMT)啟動(dòng)子的G-box區(qū)域，調(diào)控PMT基因的表達(dá)。

煙堿由2個(gè)不同的含氮環(huán)即具有2種合成途徑的吡咯環(huán)和吡啶環(huán)合成[10]。在吡咯環(huán)途徑中，鳥氨酸脫羧酶(ODC)可直接使鳥氨酸脫羧形成腐胺[11]，或者間接通過精氨酸脫羧酶(ADC)介導(dǎo)精氨酸脫羧形成腐胺[12]。繼而，腐胺被N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)催化，形成N-甲基腐胺[13]。最后，N-甲基腐胺被N-甲基腐胺氧化酶(MPO)催化，形成煙堿的直接前體物質(zhì)。在吡啶環(huán)途徑，喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QPT)是煙堿合成代謝中的限速酶[14]。研究表明，PMT過量表達(dá)可以增加煙葉中的煙堿含量[15]，而通過反義RNA技術(shù)沉默PMT表達(dá)可以降低煙葉中的煙堿含量[16]。煙堿含量的高低是評(píng)價(jià)煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[17]，也是將其應(yīng)用于醫(yī)藥、化工及農(nóng)藥防治[18-20]等方面的依據(jù)。雜種優(yōu)勢(shì)利用是作物品種改良的一種重要手段，已逐漸成為進(jìn)一步提高動(dòng)植物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性及社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的有效措施[21]，利用雜種優(yōu)勢(shì)選育不同煙堿含量的煙草品種，將其應(yīng)用于煙葉生產(chǎn)、醫(yī)藥及農(nóng)藥防治有著實(shí)踐意義。目前，煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)制尚未得到闡明，且在轉(zhuǎn)錄因子水平上關(guān)于煙堿雜種優(yōu)勢(shì)的研究報(bào)道還比較少。

轉(zhuǎn)錄因子可以作為分子開關(guān)與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子特異結(jié)合，通過調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),高效誘導(dǎo)或抑制目標(biāo)代謝產(chǎn)物的積累[22-24]。因此，開展煙堿生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)研究，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控?zé)焿A生物合成的分子機(jī)制和煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)制，對(duì)于提高煙草的品質(zhì)和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

煙草親本VA116、GDH88、巴斯瑪及其雜交種(VA116×GDH88和VA116×巴斯瑪)均由貴州大學(xué)煙草實(shí)驗(yàn)室提供。其中，VA116×巴斯瑪和VA116×GDH88分別為貴州大學(xué)煙草實(shí)驗(yàn)室在前期研究雜交組配中篩選鑒定出來的煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合和弱優(yōu)勢(shì)組合。材料栽種于貴州大學(xué)煙草試驗(yàn)基地，分別在煙株移栽后66 d和移栽后80 d采樣，每次選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3株，取其根和中部葉片立即放入液氮冷凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 煙堿含量測(cè)定及雜種優(yōu)勢(shì)計(jì)算 煙堿含量測(cè)定采用紫外分光光度法[25]進(jìn)行，計(jì)算公式：

煙堿含量=

式中，1.059是與硅烏酸重量法相比的校正系數(shù)，A259、A236、A282分別表示在波長(zhǎng)為259、236、282 nm處測(cè)得的吸光值，V1、V2、V3分別表示原測(cè)液體積、原測(cè)液稀釋后的待測(cè)液體積、空白對(duì)照的參比液體積，m表示原測(cè)液制備中所稱取的樣品質(zhì)量。

雜種優(yōu)勢(shì)的計(jì)算方法：

正向超親優(yōu)勢(shì)=(F1-HP)/HP×100%，

中親優(yōu)勢(shì)=(F1-MP)/MP×100%，

負(fù)向超親優(yōu)勢(shì)=(F1-LP)/LP×100%。

式中，HP為雙親中的最高值，MP為雙親平均值，LP為雙親中的最低值，F(xiàn)1為雜交1代值。

1.2.2 RNA提取與cDNA第一鏈合成 取不同組織(根與葉)在液氮下充分研磨成粉末，按照OMEGA Totle RNA KitⅠ試劑盒(京工生物公司)說明書提取總RNA。總RNA經(jīng)過Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度和完整性后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)的說明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-qPCR與分析 采用RT-qPCR分析NtMYC2b及煙堿合成關(guān)鍵酶基因ODC、PMT、ADC、QPT、MPO的表達(dá)，以煙草持家基因Actin-2、HSC70-1為內(nèi)參基因。各關(guān)鍵酶基因和持家基因的PCR引物參照文獻(xiàn)[26]。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找NtMYC2b，根據(jù)Real-time PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因引物，上游引物為5′-AGAAGGTTCTACGGGAGC-3′，下游引物為5′-TAACAAACGATTGGGTCA-3′。所有引物由上海生物工程股份有限公司合成。RT-qPCR的反應(yīng)體系20 μL：Trans Start Green qPCR Super Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 s、95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算并分析RT-qPCR的數(shù)據(jù)。

1.2.4 煙堿合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子序列中MYC結(jié)合位點(diǎn)分析 利用Plant CARE在線軟件分析關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子序列是否含有MYC結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)MYC2b調(diào)控的酶基因。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有原始數(shù)據(jù)均來自3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，即重復(fù)3次的試驗(yàn)結(jié)果。采用 2-△△Ct法計(jì)算RT-qPCR的數(shù)據(jù)，分析NtMYC2b與5個(gè)關(guān)鍵酶基因在移栽后66、80 d不同組織(根與中部葉片)中的表達(dá)情況。運(yùn)用Excel和SPSS 21.0軟件，統(tǒng)計(jì)并分析NtMYC2b的相對(duì)表達(dá)量、煙堿含量及酶基因表達(dá)量間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草雜交種及其親本的煙堿含量與雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)分析

VA116×GDH88和VA116×巴斯瑪及其親本VA116、GDH88、巴斯瑪煙株不同時(shí)期、不同組織的煙堿含量及其雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)見表1和表2。從表1可見，移栽后66 d，煙草根中的煙堿含量高于葉中，而移栽后80 d，葉中的煙堿含量高于根中；與移栽后66 d相比，移栽后80 d除VA116根中煙堿含量稍有降低外，其余材料相同部位的煙堿含量均增加；無論不同取樣時(shí)間，還是不同部位，VA116×巴斯瑪?shù)臒焿A含量均高于2個(gè)親本，而VA116×GDH88的煙堿含量均介于2個(gè)親本之間。

表1 不同時(shí)期煙草親本和雜交種根與葉中的煙堿含量

由表2可知，移栽后66 d和80 d，VA116×巴斯瑪和VA116×GDH88根與葉煙堿含量的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)一致，且VA116×巴斯瑪根與葉中的煙堿含量均表現(xiàn)為正向超親優(yōu)勢(shì)，而VA116×GDH88均表現(xiàn)為弱的中親優(yōu)勢(shì)。

表2 不同時(shí)期煙草雜交種煙堿含量的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)Tab.2 Heterosis of nicotine content in tobacco hybrid lines at different stages %

2.2 煙草NtMYC2b以及煙堿合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析

由圖1可見，移栽后80 d煙草各親本根中NtMYC2b、PMT和ADC的表達(dá)量相對(duì)于移栽后66 d明顯上調(diào)，而QPT表達(dá)量則明顯下調(diào)。其中，VA116、GDH88、巴斯瑪根中NtMYC2b的表達(dá)量分別是移栽后66 d的2.97倍、11.19倍、4.25倍。巴斯瑪根中ODC的表達(dá)量明顯上調(diào)，VA116和GDH88根中ODC的表達(dá)量略有下調(diào)；GDH88和巴斯瑪根中MPO的表達(dá)量略有上調(diào)，VA116根中MPO的表達(dá)量略有下調(diào)。移栽后80 d煙草各親本葉片中ODC、PMT、ADC、QPT的表達(dá)量相對(duì)于移栽后66 d明顯上調(diào)；VA116、GDH88、巴斯瑪葉片中NtMYC2b的表達(dá)量分別是移栽后66 d的0.92倍、1.02倍、0.39倍；VA116和GDH88葉片中MPO的表達(dá)量較移栽后66 d上調(diào)，而巴斯瑪葉片中MPO的表達(dá)量下調(diào)。

A、 B分別表示根、葉

由圖2顯示，移栽后80 d，雜交種根中NtMYC2b、ODC、PMT、ADC、MPO的表達(dá)量均較2個(gè)親本平均表達(dá)量明顯上調(diào)，其中NtMYC2b在弱優(yōu)勢(shì)組合VA116×GDH88和強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合VA116×巴斯瑪根中的表達(dá)量分別是親本平均表達(dá)量的18.96倍、69.75倍；QPT在VA116×GDH88根中的表達(dá)量較親本平均表達(dá)量略有下調(diào)，而在VA116×巴斯瑪根中則明顯上調(diào)。雜交種葉片中NtMYC2b與PMT、ADC的表達(dá)量較2個(gè)親本平均表達(dá)量也明顯上調(diào)，其中NtMYC2b在弱優(yōu)勢(shì)組合VA116×GDH88和強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合VA116×巴斯瑪葉中的表達(dá)量分別是親本平均表達(dá)量的1.41倍、73.75倍；ODC、MPO和QPT的相對(duì)表達(dá)量在VA116×GDH88中分別表現(xiàn)為下調(diào)、明顯上調(diào)和下調(diào)，而在VA116×巴斯瑪中的表現(xiàn)則相反，表現(xiàn)為明顯上調(diào)、下調(diào)和明顯上調(diào)。

RT-qPCR結(jié)果表明，NtMYC2b和5個(gè)關(guān)鍵酶基因在3個(gè)親本和2個(gè)雜交種的根部和葉片中均有表達(dá)。圖1A和圖2A表明，NtMYC2b在煙草雜交種和親本根中的相對(duì)表達(dá)量均高于5個(gè)關(guān)鍵酶基因，表達(dá)量較移栽后66 d上調(diào)，較親本平均值也上調(diào)。此外，由圖2可知，無論在根或葉中，除MPO外，NtMYC2b與其他4個(gè)關(guān)鍵酶基因在強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合VA116×巴斯瑪中的相對(duì)表達(dá)量都明顯高于弱優(yōu)勢(shì)組合VA116×GDH88，且在VA116×巴斯瑪根與葉中的相對(duì)表達(dá)量較親本平均表達(dá)量均表現(xiàn)出明顯上調(diào)，而在VA116×GDH88中QPT下調(diào)且其他基因上調(diào)也不明顯。結(jié)合煙堿含量分析，NtMYC2b可能是煙堿合成的調(diào)控因子，其表達(dá)在煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)的形成上扮演著一定角色。

A、 B分別表示根、葉

2.3 NtMYC2b、關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與煙堿含量及雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)分析

表3顯示，在親本根部，NtMYC2b表達(dá)量與煙堿含量呈正相關(guān)(P>0.05)，而與PMT表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.88；此外，ADC表達(dá)量與煙堿含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.94。在雜交種根部(表4)，NtMYC2b表達(dá)量與煙堿含量及其雜種優(yōu)勢(shì)呈正相關(guān)(P>0.05)，但與ADC、MPO表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.96、0.97；此外，ADC表達(dá)量與MPO表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.98。

表3 煙草親本根中NtMYC2b、關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與煙堿含量間的相關(guān)系數(shù)Tab.3 Correlation coefficient between expression of NtMYC2b,key enzyme gene and nicotine content in tobacco parental roots

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

Note：*indicated significant correlation(P<0.05).

表4 煙草雜交種根中NtMYC2b、關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與煙堿含量間的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficient between expression of NtMYC2b,key enzyme gene and nicotine content in tobacco hybrid roots

在雜交種葉片(表5)中，NtMYC2b表達(dá)量與雜種優(yōu)勢(shì)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97；PMT表達(dá)量與ODC、ADC表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為0.98?？梢?，PMT、ADC、MPO3個(gè)關(guān)鍵酶基因在煙堿合成過程中可能受到NtMYC2b的調(diào)控，且關(guān)鍵酶基因間也可能存在互作關(guān)系；雜交種葉片中NtMYC2b表達(dá)量與煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系密切。

表5 煙草雜交種葉中NtMYC2b、關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與煙堿含量間的相關(guān)系數(shù)Tab.5 Correlation coefficient between expression of NtMYC2b,key enzyme gene and nicotine content in tobacco hybrid leaves

2.4 煙堿合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子序列中MYC結(jié)合位點(diǎn)分析

G-box被證明是與MYC2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核心位點(diǎn)[9,27-28]。在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找ADC、PMT的啟動(dòng)子序列，利用Plant CARE在線軟件分析關(guān)鍵酶基因ADC、PMT的生物學(xué)功能，結(jié)果見圖3。由圖3可見，ADC與PMT的啟動(dòng)子序列中都含有MYC結(jié)合位點(diǎn)和G-box區(qū)域。其中，在ADC啟動(dòng)子反義鏈700 bp處含有1個(gè)MYC結(jié)合位點(diǎn)(CATTTG)，正義鏈1 957 bp處有1個(gè)G-box元件(CACGTT)。PMT啟動(dòng)子中含有7個(gè)MYC結(jié)合位點(diǎn)，分別有3個(gè)CATTTG、3個(gè)CATGTG、1個(gè)CAATTG，其中，在正義鏈824 bp處有1個(gè)CATTTG，在反義鏈521 bp和986 bp處有2個(gè)CATTTG，在正義鏈1 015 bp和1 985 bp處有2個(gè)CATGTG，在反義鏈1 566 bp處有1個(gè)CATGTG，在正義鏈544 bp處有1個(gè)CAATTG；反義鏈1 991 bp處有1個(gè)G-box元件(TACGTG)。由此推測(cè)，NtMYC2b可能與ADC、PMT的順式元件MYC結(jié)合位點(diǎn)或G-box元件特異性結(jié)合調(diào)控ADC、PMT的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)煙堿的合成。

A、B分別表示ADC、PMT的啟動(dòng)子序列；+、- 分別表示正義鏈和反義鏈；方框表示MYC結(jié)合位點(diǎn)；橢圓框表示G-box元件A and B represent promoter sequences of ADC and PMT;+ and - represent justice chain and antisense chain,respectively;The box represents MYC binding site,and the oval box represents G-box element

3 結(jié)論與討論

MYC類轉(zhuǎn)錄因子具有多種調(diào)節(jié)功能，如MYC2調(diào)控著植物根[29]、花[30]、果實(shí)[31]、種子[32]及葉脈[33]的變化以及煙堿合成[9]等。MYC2轉(zhuǎn)錄因子得以發(fā)揮調(diào)控作用，主要是通過結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的核心位點(diǎn)G-box區(qū)域[9,27-28]。ZHANG等[9]研究表明，轉(zhuǎn)錄因子基因NtMYC2a和NtMYC2b在體外也能特異性結(jié)合PMT基因啟動(dòng)子的G-box區(qū)域，調(diào)控PMT基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，ADC、PMT啟動(dòng)子序列中有MYC結(jié)合位點(diǎn)及G-box區(qū)域，且在親本根部和雜交種根部，NtMYC2b表達(dá)量分別與PMT、ADC表達(dá)量顯著相關(guān)，其表達(dá)也與煙堿含量呈正相關(guān)，表明NtMYC2b可能與ADC、PMT啟動(dòng)子序列中MYC結(jié)合位點(diǎn)或G-box區(qū)域特異性結(jié)合來調(diào)控該基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控?zé)焿A的合成。

煙堿主要在根部合成，經(jīng)過木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)降厣喜浚鎯?chǔ)在液泡中。本研究發(fā)現(xiàn)，移栽后80 d，NtMYC2b在烤煙親本根中的表達(dá)量相對(duì)于移栽后66 d明顯上調(diào)，在雜交種根中相對(duì)于親本平均表達(dá)量也明顯上調(diào)，ADC、PMT表達(dá)量也明顯上調(diào)，GDH88和巴斯瑪根部煙堿含量增加，但NtMYC2b在親本葉片中的相對(duì)表達(dá)量低于根中的相對(duì)表達(dá)量，而葉片中的煙堿含量高于根中煙堿含量，這可能是因?yàn)闊焿A在根部合成后向地上部運(yùn)輸，在葉中積累的結(jié)果[34]。

雜種優(yōu)勢(shì)是指雜交種在生長(zhǎng)勢(shì)、產(chǎn)量、抗性等性狀方面優(yōu)于雙親的遺傳現(xiàn)象，在生物界普遍存在[35-37]，受多基因控制，遺傳機(jī)制復(fù)雜。目前，主要有顯性[36]、超顯性[37]和上位性假說[38]來解釋雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)制。在煙堿合成代謝的2種途徑中，QPT參與吡啶環(huán)[39]的形成，ADC、ODC[40]、PMT[41]和MPO[42]參與吡咯環(huán)的合成。本研究發(fā)現(xiàn)，NtMYC2b與ODC、ADC、PMT、QPT在煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)的組合中表達(dá)量都明顯上調(diào)，而在弱優(yōu)勢(shì)組合中QPT下調(diào)且其他基因表達(dá)量上調(diào)也不明顯，說明NtMYC2b參與了煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)的形成，且在雜交種中表現(xiàn)為超顯性表達(dá)。TIAN等[43]對(duì)雜交種(VA116×Basma)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)煙堿合成代謝相關(guān)基因(ADC、PMT、MPO、QPT、AO、QS、QPT、A622、BBLs)和煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(JAT2、MATE1、MATE2、NUP1)在雜交種中上調(diào)表達(dá)，其中大部分被證明為超顯性表達(dá)，且煙堿合成代謝在雜交種中受到誘導(dǎo)。

本研究探討了NtMYC2b與煙草煙堿含量及其雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系，結(jié)果顯示，移栽后80 d，NtMYC2b在煙草親本和雜交種根中的表達(dá)量分別較移栽后66 d和親本平均表達(dá)量呈明顯上調(diào)趨勢(shì)，且其根和葉中煙堿含量較移栽后66 d增加。NtMYC2b在強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合VA116×巴斯瑪中的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于弱優(yōu)勢(shì)組合VA116×GDH88，根和葉中煙堿含量及其雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)也具有相同的趨勢(shì)。另外，NtMYC2b表達(dá)量與ADC、PMT、MPO表達(dá)量及煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)呈顯著正相關(guān)，ADC與PMT基因中都含有MYC結(jié)合位點(diǎn)和G-box元件。因此，推測(cè)NtMYC2b可能通過與ADC、PMT的順式元件MYC結(jié)合位點(diǎn)或G-box元件特異性結(jié)合來調(diào)控ADC、PMT的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)煙堿的合成，并且NtMYC2b基因的超顯性表達(dá)參與了煙堿含量雜種優(yōu)勢(shì)的形成。