單甲基化表沒食子兒茶素沒食子酸酯的化學(xué)合成?

劉 軍， 孫 玥， 彭 凱， 萬升標??

(1. 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266003; 2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；)

兒茶素是茶葉中最重要的生理活性物質(zhì)，主要成分有四種(見圖1)，分別為表兒茶素(1，EC)、表沒食子兒茶素(2，EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(3，ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(4，EGCG)。其中，EGCG 含量最高，占兒茶素80%左右。EGCG 是兒茶素中抗氧化作用最強的一種成分，屬非酶抗氧化劑，它的抗氧化活性是維生素E的20倍，具有抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗突變、降血脂、抗衰老及減少肝損傷等生物活性[1-4]。

甲基化 EGCG 是指將 EGCG 苯環(huán)上的酚羥基轉(zhuǎn)化為甲基醚而形成的一系列衍生物。1982年，Saijo[5]首次從綠茶中分離出了表沒食子兒茶素3-O-甲基沒食子酸酯(5，3″-Me-EGCG)。1999 年，Sano等[6]于從烏龍茶中分離出了3″-Me-EGCG (5)和表沒食子兒茶素 4-O-甲基沒食子酸酯(6，4″-Me-EGCG)。Amarowicz等[7]從綠茶中分離出了3″-Me-EGCG和4″-Me-EGCG。

EGCG經(jīng)過甲基化以后，它的脂溶性和穩(wěn)定性都會得到提高。它在動物血液中的穩(wěn)定性要明顯高于EGCG，口服吸收率比EGCG高9倍，具有潛在的醫(yī)學(xué)價值和開發(fā)應(yīng)用前景[8a]。研究表明與EGCG相比，甲基化EGCG在抗過敏、降血脂等方面具有更高的生物活性。Maeda-Yamamoto等[9-11]研究表明飲用富含甲基EGCG的Benifuuki綠茶對于緩解過敏性鼻炎癥狀效果明顯，連喝一個半月的Benifuuki綠茶可有效減輕花粉癥。此外，動物實驗表明3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG可抑制Ⅰ型和Ⅳ型過敏性反應(yīng)，且抑制效果強于EGCG[12,13]。Noritaka等[12]研究表明3″-Me-EGCG 可有效防止肝細胞在肝細胞冷藏過程中被凍傷。Kawase等[14]發(fā)現(xiàn)3″-Me-EGCG 在老鼠腫瘤細胞中有著很強的抗氧化性和抗細胞毒素作用，其抗氧化性比EGCG略低，但抗細胞毒素能力約為EGCG的1.5倍。Chiu等[15]研究發(fā)現(xiàn)3″-Me-EGCG比EGCG更能有效地抑制巨噬細胞中一氧化氮(NO)的產(chǎn)生及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(I NOS)的表達，而在哮喘中，高濃度的NO可能產(chǎn)生各種不良反應(yīng)。Kurita等[16]研究發(fā)現(xiàn)3″-Me-EGCG 可明顯抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶的活性， 而Benifuuki茶抑制高血壓的效果也遠遠高于其他不含甲基化EGCG的茶。

圖1 EGCG及其衍生物Fig.1 EGCG and its derivatives

盡管甲基化EGCG尤其是3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG 生理活性顯著，穩(wěn)定性和口服生物利用度與EGCG相比明顯提高，潛在的藥物開發(fā)價值巨大，但是茶葉中天然的甲基化EGCG 含量低，很難滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。日本的科研工作者發(fā)現(xiàn)在日本42個茶樹種質(zhì)中3″-Me-EGCG 的含量介于微量與 1.516%之間，其中含量大于 1%的茶樹種質(zhì)有 3 個[8b]。此外，有研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)甲基化兒茶素在茶葉中的含量受到茶樹品種、季節(jié)、鮮葉成熟度以及加工工藝不同而存在顯著差異?？傮w來講，含有甲基化 EGCG 的茶樹品種較少，在含有甲基化 EGCG 的茶樹品種中其含量也很低，最高不超過干重的 2%，因此直接從茶葉中分離提取來獲得甲基化 EGCG面臨困難。

2006年，Wan 等[17]利用芐基保護基團完成了3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG的全合成工作，但是路線較長，總產(chǎn)率較低，不適于大規(guī)模制備。半合成方面主要分為兩種策略：一是在甲基供體存在的情況下，在適當?shù)沫h(huán)境中通過一步反應(yīng)形成甲基化兒茶素，此路線條件控制比較困難，反應(yīng)的產(chǎn)物較多，不易分離[4]；二是利用保護基團先對酚羥基進行保護，最后脫去保護基團即可得到兒茶素的單甲基化衍生物，應(yīng)用此策略的合成工作[18-19]，已有報道。本文以沒食子酸丙酯以及EGCG為原料，以芐基為保護基完成了3″-Me-EGCG (5)和4″-Me-EGCG(6)的化學(xué)合成，該方法比已有方法產(chǎn)率高，甲基化選擇性高且原料經(jīng)濟易得。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEOL JNM-EPC 500核磁共振儀(內(nèi)標TMS)； JAS-COP-1020 旋光儀，Laborota旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。綠茶粗提物(陜西森弗高科實業(yè)有限公司)；沒食子酸丙酯， 98%，北京百靈威科技有限公司；溴化芐，化學(xué)純，CP，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛，98%，北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為市售化學(xué)純或分析純，除特別說明外，不經(jīng)處理直接使用。

1.2 目標化合物的合成

如圖2所示，先將EGCG用溴化芐在碳酸鉀的條件下進行全芐基化保護，然后在碳酸鉀和乙二醇二甲醚(DME)的條件下制得五芐基化(-)-EGC (2a)。

如圖3所示，以沒食子酸丙酯(7)為原料，用4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛將鄰羥基進行保護[20]，然后用碘甲烷進行甲基化得到化合物9，用2 M的HCl溶液脫除保護基后將酚羥基用芐基保護得到化合物11，化合物11經(jīng)堿水解制成化合物12，將化合物12與已經(jīng)制得的芐基化(-)-EGC (2′) 酯化反應(yīng)得到化合物13，最后將化合物13在氫氣和氫氧化鈀碳的條件下還原得到產(chǎn)物3″-Me-EGCG(5), 核磁數(shù)據(jù)與文獻報道一致[17]。

圖2 芐基化(-)-EGC (2a)的制備Fig.2 The preparation of benzylated (-)-EGC 2a)

圖3 3″-Me-EGCG (5)的合成Fig.3 The synthesis of 3″-Me-EGCG (5)

如圖4所示，以沒食子酸丙酯(7)為原料，經(jīng)全乙酰化、選擇性甲基化、去乙酰化得到化合物16，之后再經(jīng)芐基化、水解、酯化得到化合物19，最后在氫氣和氫氧化鈀碳的作用下還原得到4″-Me-EGCG (6), 核磁數(shù)據(jù)與文獻報道一致[17]。

1.3 目標化合物的制備

圖4 4″-Me-EGCG (6)的合成Fig.4 The synthesis of 4″-Me-EGCG (6)

1.3.2 1,3-苯并二茂-5-羧酸-7-羥基-2-(4-甲氧基苯基)-，丙酯(8)的合成 向裝有分水器和冷凝管的圓底燒瓶中加入沒食子酸丙酯(0.9 g， 4.24 mmol)，4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛(2.30 mL， 12.72 mmol)，一水合對甲苯磺酸(10 mg)和甲苯(20 mL)。氮氣保護下加熱回流，攪拌反應(yīng)2 h, 將溶劑不斷從分水器中除去，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，加入二氯甲烷，將反應(yīng)液倒入分液漏斗，用40 mL飽和碳酸鈉溶液洗滌，二氯甲烷萃取(20 mL×3)，收集有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得白色固體1.26 g，產(chǎn)率90%。1H NMR (500MHz, CDCl3)δ(ppm): 1.02 (3H, t), 1.70～1.95 (2H, m), 3.81(s, 3H), 4.25 (2H, t)，6.95 (d,J=8.5 Hz, 2H), 6.96 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.45 (d,J=8.5 Hz， 2H);13C NMR (126MHz, CDCl3)δ(ppm): 164.2, 161.3, 148.9, 138.9, 138.7, 128.0, 127.3, 124.1, 114.1, 111.9, 102.9, 68.4, 55.4, 21.5, 10.2。

1.3.3 1,3-苯并二茂-5-羧酸-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-，丙酯(9)的合成 將化合物8(600 mg, 1.82 mmol)加入到10 mL DMF中，氮氣保護下加入碘甲烷(0.17 mL, 2.73 mmol),碳酸氫鈉(0.23 g, 2.73 mmol),室溫攪拌3 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入20 mL冰水中，過濾，將固體用二氯甲烷溶解，濾液用乙酸乙酯(10 mL×2)萃取，合并有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1)，得白色固體592 mg, 產(chǎn)率94%。1H NMR (500MHz, CDCl3)δ(ppm): 1.02 (3H, t), 1.70～1.95 (2H, m), 3.81 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 4.25 (2H, t)，6.95 (d,J=8.5 Hz, 2H), 6.96 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.45 (d,J=8.5 Hz， 2H);13C NMR (126MHz, CDCl3)δ(ppm): 164.3, 161.3, 148.9, 138.9, 138.7, 128.0, 127.3, 124.1, 114.1, 111.9, 102.9, 68.4, 55.9, 55.4, 21.5, 10.2。

1.3.4 3,4-二羥基-5-甲氧基苯甲酸丙酯 (10)的合成 將化合物9(400 mg, 1.16 mmol)溶于10 mL四氫呋喃中，逐滴加入1.67 mL HCl溶液，室溫攪拌反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，加入飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，反應(yīng)液濃縮后用乙酸乙酯(10 mL×3)萃取，合并有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得油狀產(chǎn)物248 mg, 產(chǎn)率94%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ(ppm): 1.02 (3H, t), 1.70～1.95 (2H, m), 3.83 (s, 3H), 4.25 (2H, t)，6.95 (s, 1H), 7.21 (s, 1H);13C NMR (126MHz, CDCl3)δ(ppm): 164.3, 145.9, 136.9, 134.7, 124.4, 111.9, 104.9, 68.4, 55.9, 21.5, 10.2。

1.3.5 3,4-二芐氧基-5-甲氧基苯甲酸丙酯(11)的合成 將化合物10(300 mg，1.33 mmol),碳酸鉀(1.8 g，13.3 mmol)加入到10 mL DMF中，氮氣保護下加入溴化芐(1.57 mL，13.3 mmol)，室溫攪拌反應(yīng)過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入20 mL冰水混合物中，乙酸乙酯(20 mL×3)萃取，合并有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=20∶1)，得白色固體490 mg，產(chǎn)率：90%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ(ppm): 7.43 (d,J=6.6 Hz, 4H), 7.38 (t,J=7.2 Hz, 3H), 7.34 (d,J=7.1 Hz, 1H), 7.32～7.27 (m, 4H), 5.14 (s, 2H), 5.11 (s, 2H), 4.26 (t,J=6.7 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 1.79 (dd,J=14.2, 7.1 Hz, 2H), 1.02 (t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ(ppm): 164.3, 153.4, 152.3, 141.0, 137.9, 137.3, 128.8, 128.5, 128.3, 128.0, 126.5, 108.4, 107.2, 74.5, 70.7, 68.4, 56.5, 21.5, 10.3。

1.3.6 3,4-二芐氧基-5-甲氧基苯甲酸(12)的合成 將化合物11(380 mg, 0.94 mmol)用10 mL四氫呋喃∶水=5∶1的混合溶液溶解，加入氫氧化鋰(90 mg, 3.76 mmol)室溫下攪拌反應(yīng)過夜，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，用1 mol·L-1的HCl溶液調(diào)pH至4～5，乙酸乙酯(10 mL×3)萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，得白色固體322 mg,產(chǎn)率95%。1H NMR (500 MHz, DMSO)δ(ppm): 7.45 (d,J=7.3 Hz, 2H), 7.42～7.36 (m, 4H), 7.34 (dd,J=4.2, 2.6 Hz, 2H), 7.32～7.28 (m, 3H), 7.26 (d,J=1.5 Hz, 1H), 5.16 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 3.83 (s, 3H)。13C NMR (126 MHz, DMSO)δ(ppm): 167.34 (s), 153.45 (s), 152.29 (s), 141.02 (s), 137.89 (s), 137.28 (s), 128.85 (s), 128.54 (s), 128.31 (d,J=3.3 Hz), 128.03 (s), 126.49 (s), 108.45 (s), 107.19 (s), 74.54 (s), 70.66 (s), 56.47 (s)。

1.3.9 3,4,5-三乙酰氧基苯甲酸丙酯(14)的合成 冰浴下，將沒食子酸丙酯(1 g，4.7 mmol)，醋酸酐(7 mL，70.5 mmol)和三乙胺(3.9 mL，28.2 mmol)溶于20 mL二氯甲烷中，緩慢升至室溫攪拌反應(yīng)4 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全。將反應(yīng)液用20 mL飽和碳酸氫鈉溶液水洗，分液，收集有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=20∶1)，得到白色固體1.53 g,產(chǎn)率96%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ7.79 (s, 2H), 4.27 (t,J=6.7 Hz, 2H), 2.30 (s, 9H), 1.77 (dd,J=14.2, 7.1 Hz, 2H), 1.00 (t,J=7.4 Hz, 3H)。13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ(ppm): 167.6, 166.4, 164.4, 143.4, 138.5, 128.7, 122.2, 67.2, 22.0, 20.6, 20.2, 10.4。

1.3.10 3,5-二乙酰氧基-4--甲氧基苯甲酸丙酯(15)的合成 將化合物14(500 mg,1.48 mmol)溶于10 mL DMF中，加入碳酸鉀(613 mg，4.44 mmol)和碘甲烷(0.11 mL，1.77 mmol)，40 ℃下攪拌反應(yīng)3 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，濾掉不溶物，加入20 mL乙酸乙酯稀釋，水洗，收集有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)，得白色固體440 mg,產(chǎn)率95%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ(ppm): 7.67 (s, 2H), 4.25 (t,J=6.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.35 (s, 6H), 1.77 (dd,J=14.2, 7.0 Hz, 2H), 1.01 (t,J=7.4 Hz, 4H) ;13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ(ppm): 167.8, 165.5, 147.8, 142.7, 126.5, 122.3, 67.2, 61.1, 22.0, 10.3。

1.3.11 3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲酸丙酯(16)的合成 將化合物15(800 mg, 2.58 mmol)溶于甲醇(10 mL)和水(2 mL)的混合溶液中，加入碳酸鉀(1.1 g，7.97 mmol)，室溫攪拌反應(yīng)2 h，TLC監(jiān)測反應(yīng)完全，蒸干溶劑，加入乙酸乙酯稀釋，用稀鹽酸調(diào)pH至2，水洗，分液，收集有機相，無水硫酸鎂干燥，過濾，蒸干，得到化合物16(565 mg),產(chǎn)率97%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ(ppm): 7.01 (s, 2H), 4.25 (t,J=6.7 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.77 (dd,J=14.2, 7.0 Hz, 2H), 1.01 (t,J=7.4 Hz, 4H);13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ(ppm): 167.4, 151.4, 141.5, 126.5, 109.8, 67.2, 61.3, 22.0, 10.4。

1.3.12 3,5-二芐氧基-4-甲氧基苯甲酸丙酯(17)的合成 合成方法同化合物11，白色固體，產(chǎn)率90%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ(ppm): 1.01 (3H, t), 1.77 (dd,J=14.2, 7.0 Hz, 2H), 3.89 (3H, s), 4.25 (2H, t), 5.20 (4H, s), 7.15～7.59 (12H, m);13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ(ppm): 167.8, 151.8, 144.2, 136.6, 128.4, 128.1, 127.0, 123.8, 109.8, 71.3, 67.2, 61.3, 22.0, 10.4。

1.3.13 3,5-二芐氧基-4-甲氧基苯甲酸(18)的合成 合成方法同12，白色固體，產(chǎn)率91%。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ(ppm): 3.89 (3H, s), 5.21 (4H, s), 7.28～7.52 (12H, m);13C NMR (126 MHz, CDCl3)δ(ppm): 171.3, 152.2, 144.4, 136.6, 128.5, 128.1, 127.4, 123.9, 109.8, 71.3, 61.2。

2 結(jié)果與討論

本文以沒食子酸丙酯和EGCG等為原料，以芐基為保護基，分別以53%和57%的總產(chǎn)率完成了3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG 的半合成，所得化合物核磁數(shù)據(jù)與文獻報道一致[17]。Aihara 等[18]以鄰硝基苯磺?；拖┍鶠楸Ｗo基完成了3″-Me-EGCG的半合成，最終總產(chǎn)率為52%，本文采用的方法與其相比，在總產(chǎn)率上提高了1%。在4″-Me-EGCG的半合成方法中，Aihara等[18]以沒食子酸烯丙酯為原料在碳酸鋰條件下直接進行單甲基化，產(chǎn)率為68%；Lai等[20]以沒食子酸丙酯為原料參照Aihara的方法得到化合物16，產(chǎn)率為83.0%。而Zhu等[21]以沒食子酸甲酯為原料，經(jīng)過全乙?；x擇性甲基化和水解得到4位甲基化的沒食子酸甲酯，三步反應(yīng)總產(chǎn)率高達96%。本文最初嘗試采用Aihara 和Lai的方法制備化合物16，但是在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)酚羥基甲基化的選擇性較差，難以選擇性得到化合物16。因此，本文參照Zhu等人的方法進行化合物16的制備，產(chǎn)率達到88.4%，最后以57%的總產(chǎn)率得到4″-Me-EGCG(6), 與Aihara等相比提高了19%。Lai 同樣采用芐基為保護基結(jié)合Aihara 的方法完成了4″-Me-EGCG 的合成工作，但是在甲基化的選擇性和總產(chǎn)率上與本文的合成方法相比有一定的差距。

綜上所述，在3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG 的化學(xué)合成中，本文探索了一種高產(chǎn)率，原料經(jīng)濟易得，操作簡易的新反應(yīng)路線，在3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG 的大規(guī)模制備上可以作為最佳選擇。

3 結(jié)語

近年來，隨著甲基化EGCG尤其是3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG 研究的深入，其顯著的生理活性和潛在的藥物開發(fā)價值引起人們越來越多的關(guān)注。但是由于甲基化EGCG 在茶葉中含量低，全合成路線長，產(chǎn)率低，均難以大量制備。本文以沒食子酸丙酯和EGCG等為原料，分別以53%和57%的總產(chǎn)率完成了3″-Me-EGCG 和4″-Me-EGCG 的半合成，是目前為止總產(chǎn)率最高的合成方法。