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    巖藻黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究?

    2019-11-21 09:11:18崔艷君王廣策孫恒一綦慧敏劉順梅
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液空白對(duì)照活力

    齊 佳, 崔艷君, 王廣策, 唐 娜, 成 敏, 孫恒一, 綦慧敏??, 劉順梅??

    (1. 濰坊醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊 261053; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東 青島 266071)

    肝臟疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激具有密切的相關(guān)性。ROS(活性氧)是細(xì)胞正常代謝活動(dòng)的產(chǎn)物,主要在線粒體中產(chǎn)生。肝臟細(xì)胞內(nèi)含有豐富的線粒體,代謝活動(dòng)活躍,更易產(chǎn)生ROS。持續(xù)和過(guò)量的ROS能引起細(xì)胞損傷,會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[1]及肝纖維化、肝硬化和終末期肝細(xì)胞癌的發(fā)生。氧化應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致其它疾病及癌癥的發(fā)生。

    巖藻黃素,英文名為fucoxanthin(FUCO),是存在于褐藻和硅藻等藻類中的色素成分,具有抗癌[2-3]、減肥和降血糖[4-5]等多種生物活性。已有研究表明,類胡蘿卜素能夠作為外源性抗氧化劑重構(gòu)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,中和過(guò)量的ROS,使細(xì)胞和組織免于過(guò)量ROS的損傷[6]。作為類胡蘿卜素家族的一員,F(xiàn)UCO已被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗氧化能力。它能清除1, 1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和超氧自由基,對(duì)單態(tài)氧具有淬滅活性[7]。FUCO還能減輕H2O2引起的猴腎成纖維細(xì)胞的DNA的損傷,抑制細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞的存活率[8]。

    H2O2是一種強(qiáng)氧化劑,是ROS的重要成員之一,易穿透細(xì)胞膜,導(dǎo)致DNA損傷和蛋白質(zhì)的破壞,常被用來(lái)建立氧化損傷細(xì)胞模型。鑒于肝病發(fā)生與氧化應(yīng)激的密切關(guān)系及FUCO具有較強(qiáng)的抗氧化活性,本文利用H2O2誘導(dǎo)小鼠BNL CL.2肝細(xì)胞建立氧化損傷細(xì)胞模型探討FUCO對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,以期為FUCO藥用活性研究及肝病治療新藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料

    1.1 儀器與試劑

    儀器:多功能酶標(biāo)儀(Molecular devices,SpectraMax M5美國(guó));CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,311,美國(guó));離心機(jī)(Thermo,Labofuge300,美國(guó));超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝,JY92-ⅡN)。

    試劑:巖藻黃素(Sigma);微量還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);MTT檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);DMEM高糖培養(yǎng)基(索萊寶);胎牛血清(四季青)。

    1.2 細(xì)胞株

    小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL CL.2:上海酶研生物科技有限公司。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    BNL CL.2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    2.2 BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷模型的建立[9]

    以H2O2誘導(dǎo)建立BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組和H2O2處理組,H2O2組設(shè)100、200、400、 600、 800、1 000、 1 200和1 600 μmol/L共8個(gè)濃度。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

    濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。24 h后,空白對(duì)照組換為無(wú)血清培養(yǎng)液,H2O2組分別換為含不同濃度H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)液,各組繼續(xù)放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, PBS清洗細(xì)胞,按照MTT試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組的細(xì)胞活力,根據(jù)細(xì)胞活力篩選建立氧化損傷模型的最適H2O2濃度。

    2.3 細(xì)胞活力測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(Con)、陽(yáng)性對(duì)照組(VE:維生素E,50 μmol/L VE+ 1 000 μmol/L H2O2)、H2O2模型組(Mod,1 000 μmol/L H2O2)和FUCO組。FUCO組設(shè)1、5、10、20 μmol/L 4個(gè)濃度,分別用 F1(1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2)、F5(5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2)、F10(10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2)和F20(20 μmol/L FUCO+ 1 000 μmol/L H2O2)表示。每組3個(gè)平行孔。

    1×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后,空白對(duì)照組和H2O2模型組換為無(wú)血清培養(yǎng)液,VE組換為含50 μmol/L VE的無(wú)血清培養(yǎng)液,F(xiàn)UCO組換為含不同濃度FUCO的無(wú)血清培養(yǎng)液。上述各組在培養(yǎng)2 h后,除空白對(duì)照組外,其余組全部加入終濃度為1 000 μmol/L的H2O2置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后用MTT法測(cè)量各組細(xì)胞的活力。

    2.4 細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放量測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)分組:設(shè)空白對(duì)照組(Con)、最大酶活性組(Max)、陽(yáng)性對(duì)照組(VE)、H2O2模型組(Mod)和FUCO組(F1、F5、F10、F20)。VE組、Mod組及F1、F5、F10、F20組藥物濃度同2.3。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

    濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液按照200 μL/孔 接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。24 h后,棄掉培養(yǎng)液,PBS清洗一次。Con、Max和Mod組換為無(wú)血清培養(yǎng)液,VE組換為含50 μmol/L VE的無(wú)血清培養(yǎng)液,F(xiàn)1、F5、F10及F20組換為含相應(yīng)濃度FUCO的無(wú)血清培養(yǎng)液。藥物與細(xì)胞預(yù)孵育2 h后,除Con和Max組外,其余組全部加入終濃度為1 000 μmol/L 的H2O2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,Max組加入10 μL LDH釋放試劑后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 h后,分別取各孔的細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中,400g離心5 min,各取120 μL上清加入96孔培養(yǎng)板中,增設(shè)只加藥物的空白背景孔。各孔分別加入60 μL LDH工作液,混勻后于25 ℃避光烘箱孵育30 min。酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各組吸光度,計(jì)算乳酸脫氫酶釋放率。計(jì)算公式為:LDH釋放率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100%。

    2.5 細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)分組及各組細(xì)胞處理方法同2.3。細(xì)胞懸液接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),重復(fù)3次。

    細(xì)胞處理結(jié)束后,胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,PBS清洗細(xì)胞,用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后取一定量細(xì)胞懸液用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取勻漿上清液100 μL,加入試劑一100 μL混勻后于3 500 g/min離心10 min,取上清液待測(cè)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書,按照表1進(jìn)行反應(yīng)體系的操作。將反應(yīng)物混勻后,靜置5 min,在酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各組吸光度,計(jì)算GSH含量。計(jì)算公式:GSH含量=[(測(cè)定孔-空白孔)/(標(biāo)準(zhǔn)孔-空白孔)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol/L)×2÷蛋白濃度。

    表1 GSH檢測(cè)反應(yīng)體系Table 1 The reaction system for GSH test /μL

    2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)分組同2.3,每組3個(gè)平行孔。

    1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔200 μL。24 h后,Con和Mod組換為無(wú)血清培養(yǎng)液,VE組及F1、F5、F10和F20組分別換為含相應(yīng)藥物及濃度的無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,除Con外,其余各組均加入終濃度為1 000 μmol/L的H2O2處理30 min。DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋使其終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后先去除各孔內(nèi)的培養(yǎng)液,再加入適當(dāng)體積上述DCFH-DA培養(yǎng)液,放于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后用PBS清洗3次,5 min/次,充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng),525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果與討論

    3.1 BNL CL.2細(xì)胞氧化損傷模型的建立

    不同濃度H2O2處理BNL CL.2細(xì)胞24 h后,各組細(xì)胞活力見(jiàn)圖1??瞻讓?duì)照組細(xì)胞活力設(shè)為100%。與對(duì)照組相比,100、200、400、 600、 800、1 000、 1 200、1 600 μmol/L H2O2組細(xì)胞活力分別下降至(88.90±8.54)%、 (85.67±10.90)%、(83.67±12.64)%、(79.75±13.61)%、(75.60±14.90)%、(65.76±18.19)%、(64.67±15.59)%和(58.21±12.81)%。細(xì)胞活力隨著H2O2濃度的增加而下降,且逐漸出現(xiàn)細(xì)胞觸角消失、形態(tài)變圓、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清等現(xiàn)象。

    圖1 建立氧化損傷細(xì)胞模型H2O2作用濃度篩選 (n=3 )Fig.1 Screening of H2O2 concentration for the establishment of oxidatively damaged cell model (n=3 )

    由于H2O2濃度過(guò)大,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡甚至死亡,因此,我們選擇細(xì)胞存活率在(65.76±18.19)%之間的1 000 μmol/L H2O2作用24 h來(lái)建立氧化損傷模型進(jìn)行后續(xù)研究。該作用濃度與liu等[9]用來(lái)誘導(dǎo)BNL CL.2氧化損傷所用的H2O2濃度相同。

    3.2 FUCO提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的活力

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。Con組細(xì)胞活力設(shè)為100%,Mod組的細(xì)胞活力下降至(65.76±18.19)% (vs Con,P< 0.01)。而藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h后經(jīng)H2O2處理24 h,VE組細(xì)胞活力上升至(88.47±10.61)% (vs Mod,P<0.05)。F1、F5及F10組細(xì)胞活力均比Mod組增加,但三者與Mod組相比無(wú)明顯差異(P> 0.05),F(xiàn)20組的細(xì)胞活力明顯高于Mod組(P< 0.05),為(91.54±10.45)%。

    (*: 與空白對(duì)照組相比, P<0.05;#: 與模型組相比, P<0.01. *: P<0.05, vs Con;#: P<0.01, vs Mod. Con: 空白對(duì)照組Control group;Mod:1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2 Modle group;F1:1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F5:5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; F10:10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F20:20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; VE: 50 μmol/L VE+ 1 000 μmol/L H2O2。)

    H2O2可誘發(fā)細(xì)胞損傷和凋亡,可使細(xì)胞活力下降。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),1~20 μmol/L的FUCO與細(xì)胞預(yù)孵育2 h可減輕H2O2對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷,F(xiàn)UCO組的細(xì)胞活力均高于H2O2處理組。這與Heo等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Heo等用H2O2處理猴腎成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)5~200 μmol/L的FUCO均可顯著提高H2O2損傷細(xì)胞的活力。

    3.3 FUCO降低H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放量

    將最大酶活性組LDH釋放率設(shè)為100%,各組細(xì)胞的LDH釋放率見(jiàn)圖3。Con組LDH釋放率為(25.94±5.01)%,Mod組增至(66.66±5.19)%,比Con組明顯提高(P< 0.05)。但藥物與細(xì)胞預(yù)孵育2 h后再經(jīng)H2O2處理,VE組和4個(gè)FUCO組的LDH釋放率均比Mod組明顯降低(P< 0.05),其中5 μmol/L FUCO組釋放率最低,為(28.48±5.86)%, 對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于50 μmol/L 的VE(35.27%±4.96%)。

    LDH是活細(xì)胞漿內(nèi)酶,當(dāng)細(xì)胞損傷、細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變時(shí),胞內(nèi)的LDH會(huì)透過(guò)細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外,LDH檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞膜破壞程度的重要指標(biāo)[10]。過(guò)量ROS可引起細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子的破壞,細(xì)胞內(nèi)的LDH就會(huì)釋放出來(lái)。本研究發(fā)現(xiàn)1~20 μmol/L的FUCO能顯著降低模型細(xì)胞LDH的釋放水平(P<0.05),表明FUCO可以抵御H2O2對(duì)細(xì)胞膜的破環(huán)作用,保護(hù)細(xì)胞膜的完整性,減輕H2O2引起的細(xì)胞毒性。

    (*: 與空白對(duì)照組相比, P<0.05;#: 與模型組相比, P<0.01. *: P<0.05, vs Con;#: P<0.01, vs Mod. Con: 空白對(duì)照組Control group;Mod:1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2Modle group; F1:1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F5:5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F10:10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F20:20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; VE:50 μmol/L VE+1 000 μmol/L H2O2。)

    3.4 FUCO提高H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的還原型谷胱甘肽含量

    圖4所示為各組細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量。Con組細(xì)胞的GSH設(shè)為100%。從圖中可以看出,與Con組相比, Mod組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量明顯降低(P<0.05),下降至(72.55±5.00)%。VE和1~20 μmol/L的FUCO均可使細(xì)胞內(nèi)的GSH含量顯著增加(P< 0.01),且FUCO的作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,20 μmol/L組GSH含量最高。

    GSH是機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化劑之一。H2O2刺激細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的GSH可被H2O2氧化生成 氧化型谷胱甘肽GSSG,從而減少了脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成,可使細(xì)胞和機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1~20 μmol/L的FUCO可使H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著增加。Ha等[11]的小鼠實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)FUCO能通過(guò)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的高表達(dá)減輕高脂飼料引起的氧化應(yīng)激。上述結(jié)果表明FUCO有可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞和機(jī)體的抗氧化酶表達(dá)發(fā)揮其抗氧化作用。

    (*: 與空白對(duì)照組相比, P<0.05;#: 與模型組相比, P<0.01. *: P<0.05, vs Con;#: P<0.01, vs Mod. Con: 空白對(duì)照組Control group;Mod:1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2 Modle group;F1:1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F5:5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F10:10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F20:20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2; VE:50 μmol/L VE+ 1 000 μmol/L H2O2。)

    3.5 FUCO降低H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞的活性氧

    DCFH-DA是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS常用的探針,是一種非熒光性化合物,在細(xì)胞內(nèi)可被ROS催化產(chǎn)生能發(fā)熒光的DCF,從而可反映細(xì)胞內(nèi) ROS 的含量[12]。本實(shí)驗(yàn)用此方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的結(jié)果如圖5所示。Con組細(xì)胞內(nèi)ROS為84.95±8.78,Mod組的ROS與對(duì)照組相比明顯增高(P< 0.05),為130.44 ±4.22。藥物與細(xì)胞預(yù)孵育24 h再經(jīng)H2O2處理30 min,50 μmol/L VE與1、5及10 μmol/L的FUCO 均可顯著抑制H2O2引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS升高(vs Mod,P< 0.05),20 μmol/L的FUCO雖然沒(méi)能明顯降低ROS含量(P> 0.05),但也表現(xiàn)出了良好的清除ROS活性,20 μmol/L FUCO組細(xì)胞的ROS含量低于H2O2模型組。

    LDH檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1~20 μmol/L FUCO可顯著降低細(xì)胞LDH的釋放,但20 μmol/L FUCO對(duì)LDH的抑制作用較1、5及10 μmol/L FUCO稍弱。這個(gè)結(jié)果可能與20 μmol/L FUCO對(duì)ROS的清除能力低于1~10 μmol/L FUCO有關(guān)。20 μmol/L FUCO對(duì)ROS的清除能力差,細(xì)胞內(nèi)存在的ROS就多,對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力強(qiáng),因此細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放就會(huì)增多。

    盡管20 μmol/L FUCO對(duì)ROS的清除能力較差,但20 μmol/L FUCO組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量卻較1、5、10 μmol/L FUCO組要高。細(xì)胞內(nèi)的高GSH含量可能與20 μmol/L FUCO組細(xì)胞的活力最高有一定關(guān)系。

    綜合考慮上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,F(xiàn)UCO有可能通過(guò)多種復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免于H2O2造成的氧化損傷,而不是通過(guò)單一或簡(jiǎn)單的方式應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激,具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究和探討。

    (*: 與空白對(duì)照組相比, P<0.05;#: 與模型組相比, P<0.05。*: P<0.05, vs Con;#: P<0.05, vs Mod. Con: 空白對(duì)照組Control group;Mod:1 000 μmol/L H2O2 模型組1 000 μmol/L H2O2 Modle group;F1:1 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F5:5 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F10:10 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;F20:20 μmol/L FUCO+1 000 μmol/L H2O2;VE:50 μmol/L VE+1 000 μmol/L H2O2。)

    4 結(jié)語(yǔ)

    本研究發(fā)現(xiàn)1~20 μmol/L 的FUCO能夠清除H2O2誘發(fā)的胞內(nèi)ROS,提高細(xì)胞GSH含量,降低細(xì)胞LDH釋放率,提高細(xì)胞活力,具有良好的抗氧化作用。

    抗氧化劑發(fā)揮抗氧化的作用主要通過(guò)2種方式:一是通過(guò)直接清除活性氧類物質(zhì)發(fā)揮作用,二是通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)間接發(fā)揮作用。綜合考慮本文及他人的研究結(jié)果,推測(cè)FUCO主要是通過(guò)直接清除ROS和誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)2種方式,通過(guò)多條調(diào)控路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。

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