c-Myc基因在櫛孔扇貝年周期發(fā)育性腺中的表達(dá)特征?

楊丹丹， 鄧 春， 楊乾坤， 秦貞奎， 張志峰

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

c-Myc(cell-Myc)是一種原癌基因，屬于骨髓細(xì)胞瘤癌基因(myelocytomatosisviraloncogene，Myc)家族成員。該家族蛋白的羧基端均具有高度保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix，HLH)和亮氨酸拉鏈(leucine zipper，LZ)組成的結(jié)構(gòu)域[1-2]。在人(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)中，c-MYC作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化和調(diào)控腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用[1，3]。c-MYC通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G1/S的過渡促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且高水平的c-MYC可間接拮抗細(xì)胞周期抑制因子的活性來激活細(xì)胞周期[4-5]。正常細(xì)胞中，c-Myc通常呈低水平表達(dá)；當(dāng)生物體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生染色體轉(zhuǎn)位、基因重排或擴(kuò)增時(shí)會(huì)引起DNA損傷，此時(shí)c-Myc基因?qū)⒈患せ?，其編碼的蛋白高水平合成，并導(dǎo)致腫瘤的形成[6-7]。此外，c-MYC更是一種誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的重編程因子[8]，具有促進(jìn)染色體解聚，加快細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞衰老的作用[9-10]。

性腺發(fā)育及配子發(fā)生是生命繁衍的基礎(chǔ)，其受多種因素的精密調(diào)控，涉及眾多基因的有序參與。c-Myc基因在性腺發(fā)育中的研究，目前僅見在文昌雞(Gallusgallus)中的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)控文昌雞的卵巢早期發(fā)育及成熟過程[11]。在貝類中，已有報(bào)道揭示c-Myc具有廣泛的組織分布特點(diǎn)[12-16]，并以性腺中的表達(dá)水平最高[14-15]。然而，其在貝類性腺中的細(xì)胞學(xué)定位和相關(guān)功能，迄今尚不清楚。本研究以重要經(jīng)濟(jì)貝類——櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)為研究對(duì)象，采用RACE技術(shù)克隆其全長(zhǎng)cDNA序列，采用定量PCR技術(shù)，分析其在櫛孔扇貝不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)動(dòng)力學(xué)特征，原位雜交和免疫組織化學(xué)手段，揭示了c-MycmRNA及其蛋白在其配子發(fā)生過程中的細(xì)胞學(xué)定位。研究旨在為開展櫛孔扇貝c-Myc基因的功能及探究貝類性腺發(fā)育及配子發(fā)生相關(guān)過程的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

櫛孔扇貝購自青島臺(tái)東南山市場(chǎng)，產(chǎn)地為青島沙子口。將不同季節(jié)購買的二齡性成熟的櫛孔扇貝在實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)3 d后，選取活力良好的個(gè)體(殼高(63.9±4.1) mm)，解剖取其性腺，剔除其中的消化管并剪成小塊。一部分在液氮中速凍后置于-80 ℃ 冰箱中保存，用于總RNA提??；另一部分使用4%多聚甲醛(溶于0.01 mol/L的 PBS 中，pH=7.4)4 ℃ 固定 22 h，于梯度甲醇(25%、50%、75%和無水甲醇，0.01 mol/L PBS 配制，pH=7.4)中脫水后， 置于-30 ℃ 冰箱中保存，用于原位雜交及免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

按照廖承義等[17]、Liu等[18]所描述的櫛孔扇貝性腺組織學(xué)特征，將櫛孔扇貝性腺劃分為4個(gè)發(fā)育時(shí)期，休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和RACE cDNA第一鏈合成 采用異硫氰酸胍法提取櫛孔扇貝成熟期精巢的總RNA，使用RNase-free DNase I消除基因組DNA，紫外光分光光度計(jì)和1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。使用SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國(guó))并按照操作指南合成RACE cDNA第一鏈。

1.2.2 目的片段全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析 根據(jù)櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組(NCBI Sequence Read Archive數(shù)據(jù)庫序列號(hào)： SRX218546，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX218546/)c-MyccDNA序列片段設(shè)計(jì)RACE特異引物，5’RACE：GTTGAGTC CGTTTGCCCCCCTCACA和3’RACE：GTACGCG GGGAGACTT GCGAAGTGG。以成熟期精巢cDNA為模板，用SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國(guó))分別進(jìn)行5’-和3’-RACE擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)、連接到pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ɑ中，挑取單菌落，送往華大基因進(jìn)行測(cè)序。

使用SeqMan軟件將5’-RACE和3’-RACE片段進(jìn)行拼接，最終獲得櫛孔扇貝c-Myc全長(zhǎng)cDNA序列。使用NCBI中BLAST功能程序分析目的蛋白序列與其他物種c-MYC蛋白序列的一致性。使用Clustal X 2.0和DNAMAN軟件對(duì)櫛孔扇貝c-Myc基因所編碼的氨基酸序列與其他12個(gè)物種已知的c-MYC氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。使用MEGA 6.0.6軟件對(duì)櫛孔扇貝c-MYC氨基酸序列與其它12個(gè)已知物種的c-MYC氨基酸序列以鄰位相接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)置bootstrap為1 000。

1.2.3 qRT-PCR 按1.2.1的方法提取櫛孔扇貝各時(shí)期精巢及卵巢總RNA并制備cDNA模板。按照qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的MIQE指南[19]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，依據(jù)櫛孔扇貝c-Myc cDNA 全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，qRT-S 5’-GGACCACCGACACCACCAG -3’ 和 qRT-A 5’-ATTTCCAGACCACATACAA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為206 bp(+221～+427，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1)。以Zhou等[20]報(bào)道的櫛孔扇貝elongation factor 1 alpha (ef-1α)作為內(nèi)參基因，引物為 qRT-S 5’-GAAAGCGACAGACAAGCCAC-3’ 和qRT-A 5’-GGTAAGTTCATCAGAGCGAGCA-3’。使用SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒(大連，中國(guó))和Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)按照操作指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)生物樣本重復(fù)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，使用SPSS Statistic 軟件(version 18.0)中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)和 Tukey’s HSD檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異水平設(shè)為P<0.05。

1.2.4 原位雜交 根據(jù)櫛孔扇貝c-Myc全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增獲得了515 bp的探針序列(+2 063～+2 577)。反向引物Probe-AS：ATTTAGGTGACACTATAGAAGCG GGCAGCTTGTGGTCATTTT(下劃線為SP6啟動(dòng)子序列)，正向引物Probe-S：TAATACGACTCACTATAGGGAGACA GTTGGTCTGTTAGGCATTT(下劃線為T7啟動(dòng)子序列)，以成熟期精巢cDNA為模板，PCR擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，并按照1.2.2的方法進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。使用DIG RNA Labeling kit(Roche，瑞士)并按照操作指南進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得c-MycDIG標(biāo)記的RNA正義和反義探針。

取保存在甲醇中的性腺組織，常規(guī)石蠟切片法制備性腺切片，成熟期精巢切片厚度為4 μm，其余時(shí)期精巢及各時(shí)期卵巢切片為5 μm。使用c-Myc地高辛標(biāo)記的正義和反義探針，按照劉曉玲[21]的方法并稍加改動(dòng)進(jìn)行組織原位雜交，其中蛋白酶K(2 μg/mL，37 ℃)消化10 min，1%中性紅復(fù)染。Nikon E80i 顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5免疫組織化學(xué) 根據(jù)櫛孔扇貝c-Myc全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用以擴(kuò)增其開放閱讀框(open reading frame，ORF)序列。正向引物ORF-S：GGATCCATGGTTGTACGGACGTCA(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))，反向引物ORF-AS：CTCGAGAAAATCCCTAACTTGAAG(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))，以櫛孔扇貝成熟期精巢cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min)。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，按照1.2.2的方法進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將含有目的基因ORF序列的pMD-18T載體與pET-28a表達(dá)載體分別用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后連接、轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌中，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。次日按照1∶100接種擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD值在600 nm波長(zhǎng)下達(dá)到0.5時(shí)，加入1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)8 h，收集總蛋白。用8 mol/L的尿素溶解包涵體蛋白并用鎳柱純化重組蛋白，將純化后的蛋白送往上海生工制備兔抗c-MYC多克隆抗體。

通過Western blot檢測(cè)c-MYC多克隆抗體的有效性和特異性。使用動(dòng)物組織蛋白提取試劑盒(CoWin，中國(guó))提取成熟期櫛孔扇貝精巢的總蛋白，SDS-PAGE電泳后，按照正極-3層濾紙-PVDF膜-SDS-PAGE膠-3層濾紙-負(fù)極的順序依次將其放入轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD，美國(guó))中22 V電壓下轉(zhuǎn)膜20 min。按照1∶1 000的比例將c-MYC多克隆抗體稀釋于5%脫脂奶粉中，4 ℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h，使用DAB顯色試劑盒(Roche，瑞士)顯色3～5 min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

按1.2.4的方法制備組織切片。使用制備的c-MYC蛋白的多克隆抗體，按照Ma等[22]的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，蘇木精復(fù)染。Nikon E80i 顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 櫛孔扇貝c-Myc全長(zhǎng)cDNA及其序列特征

本文獲得的櫛孔扇貝c-MyccDNA全長(zhǎng)為2 943 bp(GenBank序列號(hào)：KY765899.1)，其中開放閱讀框?yàn)? 194 bp，共編碼397個(gè)氨基酸；5’非翻譯區(qū)為103 bp，3’ 非翻譯區(qū)為1 646 bp，含有24 bp的poly(A)尾巴。BLAST分析結(jié)果顯示，櫛孔扇貝c-MYC氨基酸序列與已知的其他物種c-MYC序列均有同源性，其中與蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)一致性最高，為97%，與太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的一致性為50%，與合浦珠母貝(Pinctadafucata)的一致性為48%，但與脊椎動(dòng)物的一致性較低，例如與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和人(H.sapiens)的一致性均為29%。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，該預(yù)測(cè)蛋白序列既具有MYC家族所特有的保守結(jié)構(gòu)域，包括羧基末端的螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)域(HLH)和亮氨酸拉鏈(LZ)，同時(shí)還具有c-MYC蛋白所特有的Myc-N轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(見圖2A)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，櫛孔扇貝的c-MYC蛋白首先與蝦夷扇貝、合浦珠母貝和太平洋牡蠣聚為一枝，進(jìn)而與囊舌蟲(Saccoglossuskowalevskii)等作為無脊椎動(dòng)物聚為一類，最后與脊椎動(dòng)物聚類。櫛孔扇貝c-MYC的系統(tǒng)進(jìn)化與經(jīng)典的物種進(jìn)化地位基本一致(見圖2B)。

2.2 c-Myc在櫛孔扇貝年周期發(fā)育性腺中的相對(duì)表達(dá)量分析

qRT-PCR結(jié)果表明，櫛孔扇貝c-Myc在性腺的整個(gè)年周期發(fā)育過程中均有一定水平的表達(dá)(見圖1)。在卵巢中，c-MycmRNA在休止期的水平較低，隨著性腺的發(fā)育和成熟，其表達(dá)量逐漸升高；成熟期卵巢中的c-MycmRNA水平約為休止期的2.5倍(P<0.05)。在精巢中，休止期的c-MycmRNA水平最低；發(fā)育至增殖期，其水平顯著提升至休止期的1.5倍(P<0.05)，之后，在生長(zhǎng)期的精巢中維持該表達(dá)水平；至成熟期精巢其表達(dá)水平顯著低于增殖期和生長(zhǎng)期(P<0.05)，但略高于休止期精巢的表達(dá)水平(見圖1)。此外，c-MycmRNA水平在生長(zhǎng)期和成熟期的精巢和卵巢中具有顯著性差異(P<0.05)，尤其是成熟期，卵巢中的表達(dá)水平約為精巢的2倍；但在休止期和增殖期的兩性性腺中，其表達(dá)水平無顯著差異。

(所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)；休止期精巢中的c-Myc mRNA水平設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)1，其它數(shù)值均為與其的倍數(shù)表示。不同字母表示各組數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)。Data are indicated as the mean±SEM from three independent samples which are detected in duplicate. The expression level in the testes at resting stage is set as 1.00 to calibrate the relative levels in gonads at other stages. Different letters indicate significant differences from each other (P<0.05).)

2.3 櫛孔扇貝c-Myc mRNA和c-MYC蛋白在性腺中的細(xì)胞定位

原位雜交結(jié)果顯示，櫛孔扇貝c-MycmRNA在不同發(fā)育時(shí)期的精巢和卵巢中均檢測(cè)到陽性信號(hào)(見圖3 A～H和圖4 A～H)。在精巢中，c-MycmRNA主要在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中表達(dá)，在精細(xì)胞及成熟精子中未見陽性信號(hào)(見圖3 A～H)。在卵巢中，該陽性信號(hào)主要定位在卵原細(xì)胞和各期卵母細(xì)胞中(見圖4 A～H)。

(Myc-N結(jié)構(gòu)域、HLH結(jié)構(gòu)域和LZ結(jié)構(gòu)域分別用方框標(biāo)記。Myc-N-box, HLH box and LZ box are boxed.)

Western blot結(jié)果顯示，櫛孔扇貝重組c-MYC蛋白制備的多克隆抗體在成熟期精巢中檢測(cè)出一條特異性條帶，其分子量與櫛孔扇貝c-MYC蛋白的理論值(45 kDa)大小基本一致(見圖3 I)。使用重組c-MYC蛋白制備的多克隆抗體(見圖3 I)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示櫛孔扇貝c-MYC蛋白在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的細(xì)胞學(xué)定位(見圖3 J～P和圖4 I～P)與原位雜交結(jié)果基本一致(見圖3 A～H和圖4 A～H)。

(A～G.反義探針的原位雜交，其中藍(lán)色為陽性信號(hào)； A.休止期；B.增殖期；D.生長(zhǎng)期；F.成熟期；C、E和G分別為B、D和F的局部放大圖；H.正義探針的原位雜交(陰性對(duì)照)。I.Western blot檢測(cè)在櫛孔扇貝成熟期精巢提取物中出現(xiàn)一條特異條帶(箭頭所示)；Mar.蛋白marker；1.一抗為c-MYC蛋白多克隆抗體；2.陰性對(duì)照，一抗為免疫前血清。J～P、c-MYC多克隆抗體的免疫組織化學(xué)，其中棕色為陽性信號(hào)；J.休止期；K.增殖期；M.生長(zhǎng)期；O.成熟期； L和N分別為K和M的局部放大圖；P.免疫前血清的免疫組織化學(xué)(陰性對(duì)照)。Sg.精原細(xì)胞；Sc.精母細(xì)胞；St.精細(xì)胞；Sz.成熟精子。標(biāo)尺：μm。A～G. in situ hybridization with the antisense probe, positive signals are indicated in blue; A. resting stage; B. proliferative stage; D. growing stage; F. mature stage; C, E and G. the magnified images of B, D and F, respectively; H. in situ hybridization with sense probe (negative control). I. The specific band as shown with the arrow was detected in testis extracts by Western blot. Mar. Protein molecular weight marker; 1. the first antibody is anti-c-MYC polyclonal antibody; 2. negative control, the first antibody is preimmune serum. The arrow indicates the target band. J～P. immunohistochemistry with anti-c-MYC polyclonal antibody, positive signals are indicated in brown; J. resting stage; K. proliferative stage; M. growing stage; O. mature stage; L and N. the magnified images of K and M, respectively; P. immunohistochemistry with preimmunue serum (negative control). Sg. spermatogonium; Sc. spermatocyte; St. spermatid; Sz. spermatozoon. Scalar bar, μm.)

(A～G，反義探針的原位雜交，其中藍(lán)色為陽性信號(hào)； A：休止期；B：增殖期；D：生長(zhǎng)期；F：成熟期；C、E和G分別為B、D和F的局部放大圖；H，正義探針的原位雜交(陰性對(duì)照)。I-P，c-MYC多克隆抗體的免疫組織化學(xué)，其中棕色為陽性信號(hào)；I，休止期；K，增殖期；M，生長(zhǎng)期；O，成熟期；J、L和N分別為I、K和M的局部放大圖；P，免疫前血清的免疫組織化學(xué)(陰性對(duì)照)。Og：卵原細(xì)胞；Oc：卵母細(xì)胞；MO：成熟卵。標(biāo)尺：μm。A～G, in situ hybridization with the antisense probe, positive signals are indicated in blue; A, resting stage; B, proliferative stage; D, growing stage; F, mature stage; C, E and G, the magnified images of B, D and F, respectively; H, in situ hybridization with sense probe (negative control). I-P, immunohistochemistry with anti-c-MYC polyclonal antibody, positive signals are indicated in brown; I, resting stage; K, proliferative stage; M, growing stage; O, mature stage; J, L and N, the magnified images of I, K and M, respectively; P, immunohistochemistry with preimmunue serum (negative control). Og, oogonium; Oc, oocyte; MO, mature oocyte. Scalar bar, μm.)

3 討論

本文通過RACE技術(shù)獲得櫛孔扇貝c-MyccDNA全長(zhǎng)，共2 943 bp，其中ORF 1 194 bp。在該序列所推導(dǎo)的氨基酸序列中含有Myc家族保守的位于羧基末端的螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)域(HLH)和亮氨酸拉鏈(LZ)[1-2]，同時(shí)還具有c-MYC蛋白所特有的Myc-N轉(zhuǎn)錄激活區(qū)[1]。同源對(duì)比結(jié)果顯示，櫛孔扇貝c-MYC蛋白與無脊椎動(dòng)物c-MYC蛋白具有較高的一致性。初步確定本研究所獲得的序列為櫛孔扇貝c-MyccDNA全長(zhǎng)。

貝類種類繁多，生殖方式多樣，既有雌雄異體(櫛孔扇貝)也有雌雄同體(海灣扇貝)，一些物種(牡蠣等)甚至具有性逆轉(zhuǎn)特征[23]，因此研究其性腺發(fā)育、性別分化和配子發(fā)生相關(guān)基因，對(duì)于揭示其多樣的生殖方式形成機(jī)制是十分重要的。本研究采用定量PCR、原位雜交和免疫組織化學(xué)技術(shù)，確定c-Myc在櫛孔扇貝不同發(fā)育時(shí)期精巢和卵巢中均有明顯的表達(dá)(見圖2～4)。櫛孔扇貝c-MycmRNA的水平在成熟期前的精巢和卵巢中均隨著性腺發(fā)育的進(jìn)程逐漸升高，但其在成熟期精巢和卵巢中的表達(dá)則呈顯著性差異，即卵巢中的表達(dá)水平顯著高于精巢(見圖2)。韓威等[11]采用qRT-PCR檢測(cè)了文昌雞母雞個(gè)體早期發(fā)育和性成熟過程中卵巢c-Myc的表達(dá)，結(jié)果顯示其在個(gè)體發(fā)育早期的卵巢(11～12周齡)中表達(dá)水平顯著高于個(gè)體性成熟啟動(dòng)時(shí)期的卵巢(13周齡)(P<0.05)，后者僅為12周齡的20%。隨著卵巢發(fā)育成熟至開產(chǎn)期(15周齡)時(shí)，卵巢中的c-Myc表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，并且隨著發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)量顯著高于個(gè)體發(fā)育早期卵巢中的表達(dá)水平(P<0.05)，這一表達(dá)特征與櫛孔扇貝不同。由于當(dāng)前有關(guān)c-Myc在動(dòng)物性腺發(fā)育過程中的表達(dá)特征僅見文昌雞中的報(bào)道，因此這種表達(dá)特征的規(guī)律性尚有待更多的研究數(shù)據(jù)才能定論。

在櫛孔扇貝精巢中，c-MycmRNA和c-MYC蛋白明顯的陽性信號(hào)均定位在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中，而在精細(xì)胞及成熟精子中未見陽性信號(hào)(見圖3)。這種差異的細(xì)胞學(xué)定位，可能暗示c-Myc基因在精子發(fā)生過程中發(fā)揮作用。在小鼠的成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞以及人的B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)c-MYC可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G1/S的過渡以加速細(xì)胞增殖，并且高水平的c-MYC可間接拮抗細(xì)胞周期抑制因子p21和p27的活性，從而激活細(xì)胞周期[4-5, 24]。Wang等[25]通過在體內(nèi)和體外分別敲降乳腺癌細(xì)胞中的c-MycmRNA水平，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的增殖減緩，細(xì)胞的生長(zhǎng)率降低50%～60%。在動(dòng)物的精子發(fā)生過程中，細(xì)胞增殖主要發(fā)生在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中，即精原細(xì)胞通過增殖產(chǎn)生更多的精原細(xì)胞；初級(jí)精母細(xì)胞通過第一次減數(shù)分裂產(chǎn)生次級(jí)精母細(xì)胞，后者再進(jìn)行一次分裂產(chǎn)生2個(gè)精細(xì)胞，精細(xì)胞不再分裂而直接分化為精子。根據(jù)本研究中c-Myc基因在精巢中的細(xì)胞定位特點(diǎn)，我們推測(cè)其可能參與櫛孔扇貝精子發(fā)生過程中的細(xì)胞增殖調(diào)控。然而，對(duì)于c-Myc基因在櫛孔扇貝卵巢中廣泛表達(dá)的意義，我們尚無法解釋，有待進(jìn)一步的研究和闡釋。