UPLC-MS法對(duì)鹽膚木果實(shí)及其油脂中漆酚成分的分析

閔運(yùn)江，王廣林，黃 燕

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.皖西學(xué)院 分析測(cè)試中心，安徽 六安 237012)

鹽膚木(RhuschinensisMill.)是漆樹(shù)科鹽膚木屬[Rhus(Tourn.)L. emend. Moeneh]的一種落葉小喬木或灌木。廣泛分布于我國(guó)的除東北、內(nèi)蒙古和新疆外的其余各省區(qū)，多生長(zhǎng)在海拔170—2700米的陽(yáng)坡、曠地、路邊、林緣，也有生于溝谷、溪邊的疏林或灌叢中。印度、中南半島、馬來(lái)西亞、印度尼西亞、日本和朝鮮亦有分布[1](P99-101)。

鹽膚木是中國(guó)主要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種之一，可供制藥和作工業(yè)染料的原料，是生產(chǎn)重要中藥材五倍子的寄主植物，其葉又為山區(qū)群眾養(yǎng)豬的野生飼料[2](P299-300)。

鹽膚木的根、葉、枝干、皮部、果實(shí)和種子均可入藥，有不少研究報(bào)道，其醇提物具有抗病毒、抗菌、抗氧化及降低膽固醇等活性[3-5]；其具有清熱解毒、舒筋活絡(luò)、散瘀止血、澀腸止瀉等功效[6-7]。

在園林綠化中，鹽膚木因其葉秋季鮮紅，枝頭果實(shí)繁多而作為觀葉、觀果的樹(shù)種?；ㄩ_(kāi)于8—9月，蜜、粉都很豐富，是良好的蜜源植物[8-9]。

鹽膚木果實(shí)及其種子均含豐富的油脂，初步研究表明，野生鹽膚木果實(shí)中的油脂平均含量高達(dá)18%左右，其中以不飽和脂肪酸為主，含量可達(dá)72%，極具開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值[10-12]。

然而，鹽膚木(RhuschinensisMill)為漆樹(shù)科鹽膚木屬，與漆屬的漆樹(shù)同屬于漆樹(shù)族近緣物種，因此，鹽膚木果實(shí)及果油中，是否含有漆樹(shù)的生漆中可致敏性成分——漆酚，是研究鹽膚木油脂作為食用油脂的主要隱患之一。

R=(CH2)14CH3 orR=(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 orR=(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)2CH3 orR=(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH=CHCH3 orR=(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH2 and others圖1 漆酚的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

漆酚(Urushiol)在生漆中占其干重的50%～75%[13]，是一類(lèi)以鄰苯二酚為主結(jié)構(gòu)的烴基酚類(lèi)化合物(如圖1)，其側(cè)鏈R為不同飽和度的直鏈C15～C17的烴基，是幾個(gè)密切相關(guān)的有機(jī)化合物的混合物[14]，由于其側(cè)鏈R中包括飽和、單烯、雙烯和三烯烴基的結(jié)構(gòu)相近，極性差異小，且漆酚易氧化聚合，因此漆酚單體的分離極為困難[15-16]。

鹽膚木油脂品質(zhì)研究中卻需要純度較高的各種單一的飽和、不飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品，然而，目前國(guó)內(nèi)唯一可用的標(biāo)準(zhǔn)品是西安生漆研究所按照飽和漆酚的制備方法(GB/T 14703—2008)制備的飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品[17]。本文對(duì)西安生漆研究所提供的飽和漆酚中主要成分的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(UPLC-MS)，初步確定其中主要成分，進(jìn)而對(duì)鹽膚木果油及鹽膚木果實(shí)醇提物中漆酚含量進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究鹽膚木中漆酚成分及其含量，進(jìn)而，為鹽膚木油脂食用的安全性控制提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

液-質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 1290II/6545 Q-TOF)、超聲清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、CO2超臨界萃取裝置(HA120-50-01-C型，南通市華安超臨界萃取有限公司)，等。

1.2 材料和試劑

飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品(西安生漆研究所)、甲醇(質(zhì)譜純，法國(guó)默克公司)、甲酸(質(zhì)譜純)、超純水、無(wú)水乙醇(分析純)、鋼瓶裝CO2(食品級(jí))，等。

飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：

取2 mL離心管，用甲醇清洗三次，晾干備用，精確稱(chēng)取飽和漆酚1.0 mg，加入1 mL甲醇，搖勻，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，得1 mg/mL飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用甲醇稀釋成所需濃度，供液相色譜-質(zhì)譜分析用。

鹽膚木果油及醇提物4個(gè)樣品的分析樣液的制備：

1#樣：鹽膚木果實(shí)乙醇提取液，用CO2超臨界萃取法，先提取出其中的油脂后，以無(wú)水乙醇作攜帶劑，提取果渣中醇溶性物質(zhì)，所得的乙醇提取液，4 ℃靜置過(guò)夜，取上清液1.0 mL，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得1#樣液。

2#樣：壓榨鹽膚木果油，鹽膚木果實(shí)經(jīng)焙炒后，小型榨油機(jī)壓榨出的毛油，桶裝冰柜內(nèi)保存，樣品制備前回溫(適當(dāng)加熱升溫?zé)崛?，吸取該油脂1.0 mL，于5 mL離心管中，加甲醇1.0 mL，充分搖勻，萃取其中多酚類(lèi)物質(zhì)，4 ℃靜置過(guò)夜，取上清液(甲醇層)，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得2#樣液。

3#樣：乙醚萃取鹽膚木果油，取用無(wú)水乙醚索氏抽提法提取的鹽膚木果油1.0 mL，于5 mL離心管中，加甲醇1.0 mL，充分搖勻，萃取其中多酚類(lèi)物質(zhì)，4 ℃靜置過(guò)夜，取上清液(甲醇層)，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得3#樣液。

4#樣：CO2超臨界萃取鹽膚木果油，取用CO2超臨界萃取法提取的鹽膚木果油1.0 mL，于5 mL離心管中，加甲醇1.0 mL，充分搖勻，萃取其中多酚類(lèi)物質(zhì)，4 ℃靜置過(guò)夜，取上清液(甲醇層)，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得4#樣液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用分析的條件[18-20]

1)超高效液相色譜(UPLC)洗脫條件：Agilent Eclipse Plus C18超高效液相色譜柱(1.8 μm，2.1×50 mm)、流動(dòng)相(A為0.1%甲酸水，B為甲醇)，洗脫梯度設(shè)置為：0～10 min，A∶B=90%∶10%、10～15 min，A∶B=80%∶20%、15～25 min，A∶B=20%∶80%、25～30 min，A∶B=10%∶90%、30～35 min，A∶B=0%∶100%，流速0.25 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜(MS)條件分別是：電子電離(EI)，負(fù)離子模式，電子電離電壓175 V(一級(jí)質(zhì)譜)，碰撞能40(二級(jí)質(zhì)譜)，分子分離器的霧化器噴霧壓力為35 PSI，干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度320 ℃，鞘氣溫度280 ℃，鞘氣流速11 L/min。

(2)一級(jí)質(zhì)譜電子電離電壓的優(yōu)選：優(yōu)化漆酚的一級(jí)質(zhì)譜電子電離的最佳電離電壓，分別采用145 V、155 V、165 V、175 V四個(gè)電壓梯度，對(duì)漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2，可見(jiàn)電壓為175 V時(shí)，譜圖漆酚離子流(M/Z=319.268)最大、出峰最好，最后選定175 V。

(3)二級(jí)質(zhì)譜碰撞能優(yōu)化：175 V電離漆酚后二級(jí)質(zhì)譜的碰撞能優(yōu)化，選擇區(qū)間為10～40，結(jié)果如圖3，圖3中從上至下依次為10、20、30、40碰撞能譜圖，其中碰撞能為40對(duì)應(yīng)的譜圖漆酚碎片離子流(M/Z=122.037)最大、出峰最好，最后選定為40。

1.3.2 飽和漆酚及四種樣品中漆酚的定性、定量分析

按照上述1.3.1的最佳液相色譜及質(zhì)譜條件，分別對(duì)飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品和鹽膚木油脂等四種樣品進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖4—圖8。

由飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的液-質(zhì)聯(lián)用分析，對(duì)鹽膚木油脂等四個(gè)樣品的二級(jí)質(zhì)譜(MSMS)分析時(shí)，掃描的質(zhì)荷比定位319.268，以質(zhì)荷比(M/Z)為122.03的漆酚分子碎片離子流峰面積(響應(yīng)值)作為飽和漆酚定量分析的依據(jù)，通過(guò)飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度與峰面積(響應(yīng)值)之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖9)，進(jìn)而依其回歸方程計(jì)算出1#—4#樣品中飽和漆酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 優(yōu)化電子電離電壓圖

圖3 優(yōu)化碰撞能圖

圖4 5種多酚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)中漆酚的總離子流出峰及其二級(jí)質(zhì)譜(MSMS)圖

圖5 1#樣(鹽膚木果實(shí)醇提物)離子流及其二級(jí)質(zhì)譜圖(截取部分圖)

圖6 2#樣(壓榨鹽膚木果油)離子流及其二級(jí)質(zhì)譜圖(截取部分圖)

圖7 3#樣(乙醚浸提鹽膚木果油)離子流及其二級(jí)質(zhì)譜圖(截取部分圖)

圖8 4#樣(CO2超臨界萃取鹽膚木果油)UPLC-MS離子流及其二級(jí)質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 飽和漆酚的主要成分

為分析鹽膚木果實(shí)中常見(jiàn)多酚類(lèi)物質(zhì)，用常見(jiàn)多酚類(lèi)物質(zhì)：沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸和咖啡酸以及飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣(混標(biāo))，分析結(jié)果如圖4。

由圖4中的五種常見(jiàn)多酚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)總離子峰圖譜中，其中最右側(cè)一個(gè)峰，即保留時(shí)間為26.365 min的離子峰即是飽和漆酚。

在漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的制備過(guò)程中，側(cè)鏈R中的不飽和鍵均在蘭尼鎳催化下加H成飽和鍵，故各種原側(cè)鏈中含雙鍵的一烯漆酚、二烯漆酚等不飽和漆酚，均成為飽和漆酚。在一級(jí)質(zhì)譜中，由圖2可知，飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)UPLC-MS，負(fù)離子模式下(即[M-H]-)準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比為319.2，即R為C15的飽和漆酚(總分子量320)，其二級(jí)質(zhì)譜峰質(zhì)荷比為122.0377的碎片(圖4)，由已知研究可知其結(jié)構(gòu)應(yīng)為[18]：

2.2 四種鹽膚木樣品中漆酚的定性分析

用上述的質(zhì)譜條件對(duì)1#—4#樣品進(jìn)行的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜分析，見(jiàn)圖5—圖8。

由圖5—圖8可以看出，上述鹽膚木4種樣品中，均有m/z為122.03的分子碎片的離子峰，因此，可以確定鹽膚木四種樣品中均有飽和漆酚成分。

2.3 四種鹽膚木樣品中漆酚的質(zhì)譜定量分析

將配制好的梯度濃度的飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，UPLC-MS分析，各自的二級(jí)質(zhì)譜用m/z為122.03的離子質(zhì)譜峰進(jìn)行定量，分析得到表1所示的結(jié)果，以濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，以離子流強(qiáng)度(信號(hào)值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖9)。

表1 飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度及峰面積

圖9 飽和漆酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

其回歸方程為：y=5029.8x-44961；R2=0.9963。

將鹽膚木果油等4種樣品在同等條件下進(jìn)行質(zhì)譜分析，其中含飽和漆酚的同種離子的離子流強(qiáng)度(信號(hào)值)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，可分別計(jì)算出四個(gè)樣品中飽和漆酚的濃度(表2)。

表2 四個(gè)樣品中飽和漆酚含量分析結(jié)果

因此，用質(zhì)譜分析法定量檢測(cè)受試的鹽膚木果油等樣品中飽和漆酚的含量在27.5～57.5 ng/mL，即27.5～57.5 μg/L。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS的一級(jí)質(zhì)譜分析，該飽和漆酚在負(fù)離子模式下其離子流的質(zhì)荷比為319.2，說(shuō)明該飽和漆酚的分子式為C21H36O2，式量為320，即其結(jié)構(gòu)中R側(cè)鏈應(yīng)該為-C15H31的飽和烴鏈，因此，上述結(jié)果中測(cè)得的各樣品中的漆酚即是該種飽和漆酚(C21H36O2)成分的含量。

3 討論

3.1 鹽膚木油脂中漆酚含量測(cè)定樣品的預(yù)處理

鹽膚木油脂黏稠度高，成分復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行多酚類(lèi)物質(zhì)的HPLC和UPLC-MS分析時(shí)，如果直接進(jìn)樣，一是油脂的成分出柱較慢，易殘留在色譜柱中而洗脫困難；二是油脂成分在這里是雜質(zhì)信號(hào)——噪音，多酚類(lèi)成分信號(hào)相對(duì)較弱，很難達(dá)到分析所需的信噪比(S/N)≥3的要求。因此，根據(jù)漆酚等多酚類(lèi)物質(zhì)易溶于甲醇或乙醇的性質(zhì)[18-20]，對(duì)鹽膚木油脂樣品進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，取一定體積的油脂，加入等體積甲醇(質(zhì)譜純)萃取其多酚類(lèi)物質(zhì)，進(jìn)而測(cè)定甲醇萃取液中多酚。

當(dāng)然，由于油脂對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)畢竟有少量溶解，結(jié)果計(jì)算時(shí)，僅僅以甲醇萃取液中漆酚含量視為鹽膚木油脂中的漆酚含量，結(jié)果可能比鹽膚木油脂中實(shí)際含量稍低。

3.2 鹽膚木果實(shí)及果油樣品中不飽和漆酚的初步質(zhì)譜分析

由于現(xiàn)有文獻(xiàn)中，只有對(duì)漆樹(shù)中的漆酚的研究[13-16，18-20]，而未見(jiàn)鹽膚木果實(shí)及其油脂中漆酚成分種類(lèi)及含量的報(bào)道，亦無(wú)漆酚系列成分中各單一組分，尤其是各種不飽和漆酚(即R基團(tuán)中含1—4個(gè)雙鍵)的標(biāo)準(zhǔn)品，因此，無(wú)法對(duì)樣品中的不飽和漆酚進(jìn)行精確定量測(cè)定。然而，現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，中國(guó)產(chǎn)生漆中的漆酚常見(jiàn)的除飽和漆酚外，尚有R側(cè)鏈為C15的含一至三個(gè)雙鍵的不飽和烴鏈，即-C15H29的一烯烴鏈、-C15H27的二烯烴鏈以及-C15H25的三烯烴鏈等，這三類(lèi)不飽和漆酚的質(zhì)荷比分別是：317.2、315.2和313.2(均為負(fù)離子模式下，即-H模式下)；以此類(lèi)推，R側(cè)鏈為C16的含一至四個(gè)雙鍵的不飽和烴鏈的不飽和漆酚的質(zhì)荷比分別是：331.2、329.2、327.2和325.2。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)的質(zhì)荷比，在4中樣品的UPLC-MS的一級(jí)質(zhì)譜的中，分別以各質(zhì)荷比數(shù)值進(jìn)行搜索各自的質(zhì)譜圖(共28個(gè)質(zhì)譜圖，限于論文篇幅，各質(zhì)譜圖略)，將各質(zhì)譜圖中顯示的離子流強(qiáng)度數(shù)據(jù)列入表3。

表3 四個(gè)樣品中不飽和漆酚的初步分析結(jié)果

注：表中X表示離子流強(qiáng)度(信號(hào)值)；tR表示離子流位置(即出峰時(shí)間/min)。

從表4中可見(jiàn)，與飽和漆酚的離子流強(qiáng)度(表中M/z=319.2的一列)進(jìn)行對(duì)比，M/z=317.2，(即含R=-C15H29的一烯烴鏈)的不飽和漆酚的含量與飽和漆酚含量相近，甚至更高一些；M/z=315.2(即含R=-C15H27的二烯烴鏈)的不飽和漆酚在4個(gè)樣品中都有，只是其的含量只有飽和漆酚的1/10左右；M/z=313.2(即含R=-C15H25的三烯烴鏈)的不飽和漆酚在4個(gè)樣品中都未檢出。

由此說(shuō)明，4個(gè)樣品中側(cè)鏈R為C15的一烯不飽和漆酚含量較高，二烯不飽和漆酚也都有，但含量稍低，三烯不飽和漆酚未檢出。

再比較側(cè)鏈R為C16的各種不飽和漆酚，與R為C15的飽和漆酚含量對(duì)比，R中含一至四個(gè)雙鍵的不飽和漆酚也都有，而且二烯和三烯不飽和漆酚含量較高，與飽和漆酚含量較近或更高；一稀和四烯不飽和漆酚的含量也與飽和漆酚含量相近或略低一些。

兩者相較，不飽和漆酚種類(lèi)較多，總含量也較飽和漆酚高，尤其是側(cè)鏈R為C16的各種不飽和漆酚和側(cè)鏈R為C15的一烯不飽和漆酚含量較高。

并由此推測(cè)，鹽膚木果實(shí)及其油脂中漆酚成分是飽和漆酚和不飽和漆酚的混合物，且有6種不飽和漆酚的含量多比飽和漆酚高。故本研究中所測(cè)的4個(gè)樣品中總漆酚含量應(yīng)該在165～345μg/L左右。

當(dāng)然，由于不飽和漆酚與飽和漆酚的性質(zhì)略有差異，以飽和漆酚離子流強(qiáng)度為對(duì)照分析不飽和漆酚，由于條件并非不飽和漆酚的最佳條件，所以，結(jié)果會(huì)稍有偏差。因此，關(guān)于鹽膚木油脂中不飽和漆酚的種類(lèi)及其含量，尚待進(jìn)一步深入研究，以確保鹽膚木油脂食用的安全性。

4 結(jié)論

以飽和漆酚為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，UPLC-MS分析3種鹽膚木果油等4個(gè)樣品中的飽和漆酚，定性分析表明，飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品中的漆酚為其分子中R為C15的飽和烴鏈，其分子式為C21H36O2，以其二級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)荷比為122.037的分子碎片離子流強(qiáng)度作為定量分析指標(biāo)，定量分析得出，4個(gè)樣品中均含有飽和漆酚，其含量在27.5—57.5μg/L之間；7種不同結(jié)構(gòu)的不飽和漆酚的一級(jí)質(zhì)譜表明，有6種不飽和漆酚在4個(gè)樣品中的含量與飽和漆酚接近或超過(guò)飽和漆酚，因此，鹽膚木果油中飽和漆酚及不飽和漆酚的總含量在165—345μg/L左右。