PD-L1分子的表達(dá)與卵巢漿液性腺癌患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床預(yù)后關(guān)系的研究

劉霞 蔡云朗

1.東南大學(xué)，江蘇南京 210000；2.泰州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇泰州 225300；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇南京 210009

卵巢漿液性腺癌(HGSOC)是上皮性卵巢癌(EOC)的主要組織學(xué)亞型。其是一個(gè)預(yù)后差的腫瘤，5年生存率約40%，這是由于診斷時(shí)已是晚期以及產(chǎn)生對(duì)化療的耐藥性[1]。近年來，研究[2]報(bào)道，腫瘤組織的微環(huán)境中具有大量腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），其在介導(dǎo)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸方面具有重要作用。同時(shí)，TAM在細(xì)胞表型上與巨噬細(xì)胞 （M2）相似且高表達(dá)CD68分子，因此CD68分子的表達(dá)對(duì)判斷腫瘤患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后具有一定指導(dǎo)作用。程序性死亡1(PD-1)通路已經(jīng)成為腫瘤中的強(qiáng)大免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。通過對(duì)其研究可以更加清楚地了解它的生理調(diào)節(jié)作用、預(yù)后意義和治療潛力。最近幾項(xiàng)研究顯示，由于PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）的相互作用在腫瘤微環(huán)境中對(duì)患者預(yù)后有顯著影響[3]。因此，該研究2010年1月—2017年6月期間選擇49例經(jīng)手術(shù)切除的原發(fā)性HGSOC標(biāo)本，并進(jìn)行臨床病理特征、預(yù)后及預(yù)測(cè)相關(guān)性方面研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集于泰州市人民醫(yī)院婦科就診的卵巢漿液性腺癌患者49例，卵巢良性疾病患者8例。依據(jù)病史、體格檢查、影像學(xué)檢查、術(shù)中所見及術(shù)后病理結(jié)果確定診斷。卵巢漿液性腺癌患者年齡平均為51.8歲，中位年齡50歲。8例卵巢良性患者年齡平均為41歲，中位年齡42歲。所有病例術(shù)前均未接受放療、化療和激素治療。

1.2 免疫組織化學(xué)法

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢癌和良性組織中PD-L1、CD68分子的表達(dá)水平。所有手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)4%福爾馬林固定，石蠟包埋，3～4 μm連續(xù)切片。方法如下：石蠟切片，65℃烤片1 h，脫蠟，檸檬酸組織修復(fù)液高壓熱修復(fù)2 min，PBS沖洗 5 min 3次；3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min 2次。5%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1 h。PBS沖洗，5 min 3次。滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30min。PBS沖洗，5 min 3次。滴加適量DAB顯色劑，鏡下觀察，顯色3～10 min，即用自來水沖洗終止顯色，脫水，透明，封片。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

應(yīng)用日本奧林巴斯電子顯微鏡進(jìn)行圖像采集。目的細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或是黃褐色顆粒為陽性染色，PDL1染色判斷：顯微鏡下觀察每個(gè)樣本，隨機(jī)選擇5～6個(gè)高倍視野。從每個(gè)樣本的染色強(qiáng)度和染色陽性的腫瘤細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)估。染色強(qiáng)度分為：0（陰性），1（弱陽性），2（中等陽性），3（強(qiáng)陽性），共 4 個(gè)級(jí)別，最終評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0（陰性），+（1～2），++（3～4）和+++（5～7）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，0不表達(dá)，+低表達(dá)，++中表達(dá)，+++高表達(dá)。CD68染色結(jié)果判斷，方法同上。

1.4 隨訪

對(duì)所有患者進(jìn)行隨機(jī)回訪，隨訪0.2～8年，隨訪時(shí)間中位數(shù)是4年，截止時(shí)間為2018年6月。評(píng)價(jià)復(fù)發(fā)的指標(biāo)為無疾病進(jìn)展生存時(shí)間（PFS），即手術(shù)切除病灶后復(fù)查時(shí)出現(xiàn)卵巢癌腫瘤標(biāo)記物 CA125升高、影像學(xué)檢查異常、腹水等復(fù)發(fā)指征；評(píng)價(jià)生存預(yù)后的指標(biāo)為總生存時(shí)間（OS），即從手術(shù)切除病灶后至死亡的時(shí)間。如患者未及時(shí)復(fù)診則予以書信、電話通知。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，PDL1分子和CD68分子與臨床病理參數(shù)的相關(guān)關(guān)系使用Chi-square檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD68分子在卵巢癌和良性組織中的表達(dá)情況

CD68在良性組織中表達(dá)如圖1，CD68分子幾乎不表達(dá)；CD68分子在腫瘤組織中表達(dá)，其中低表達(dá)16例、中表達(dá)和高表達(dá)33例。

選取3張CD68分子在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的圖片如圖 2、3、4，分別是：低表達(dá)、中表達(dá)和高表達(dá)。

圖1 陰性

圖2 低陽性

圖3 中陽性

圖4 強(qiáng)陽性

2.2 PD-L1分子在卵巢癌和良性組織中的表達(dá)情況

PD-L1分子在良性組織中表達(dá)如圖5，PD-L1分子不表達(dá)；PD-L1分子在腫瘤組織中表達(dá)，其中陰性表達(dá)及低表達(dá)35例、中表達(dá)和高表達(dá)14例。選取兩張PD-L1分子在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的圖片如圖6、7，分別是：低表達(dá)和中表達(dá)。

圖5 陰性

圖6 弱陽性

圖7 中陽性

2.3 PD-L1分子與腫瘤患者預(yù)后生存年數(shù)的關(guān)系

PD-L1分子表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后生存年數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），如圖 8。

圖8 PD-L1分子與患者生存年數(shù)之間的關(guān)系

3 討論

卵巢惡性腫瘤又稱卵巢癌，是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位。但因卵巢癌致死率高，卻占各類婦科腫瘤的首位，對(duì)婦女生命造成嚴(yán)重威脅。近些年流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示其發(fā)病率及死亡率均呈上升和年輕化趨勢(shì)[4]。盡管手術(shù)及化療等治療手段不斷改進(jìn)，但5年生存率僅從37%上升至46%，雖然早期卵巢癌患者的生存率會(huì)大大得到提升，然而做到早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷卻難以實(shí)現(xiàn)，其原因主要包括：疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及病因尚不清楚；缺乏特異性的腫瘤標(biāo)記物；相關(guān)免疫學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制研究尚未完善等[5-6]。近年來，由于醫(yī)學(xué)的發(fā)展和研究的深入，人們對(duì)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程有了全新的認(rèn)識(shí)。大量的研究[7]表明，機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。包括免疫細(xì)胞的凋亡、免疫活性物質(zhì)的分泌異常、炎癥因子的分泌異常、免疫細(xì)胞的功能失調(diào)等，從而誘發(fā)卵巢癌的進(jìn)一步的發(fā)展[8]。

PD-L1分子和CD68分子作為免疫細(xì)胞表達(dá)分子在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。PDL1是大小為40kD的跨膜蛋白，其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均可被調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，細(xì)胞信號(hào)中的PI3K因子和STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化均對(duì)PD-L1分子的轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵作用。NF-κB是PD-L1啟動(dòng)子中的重要元件，因此通過作用NF-κB可以起到抑制PD-L1表達(dá)的作用。在翻譯水平，PTEN基因的改變導(dǎo)致下游相關(guān)基因發(fā)生變化進(jìn)而改變PD-L1分子的翻譯。 該研究結(jié)果顯示，CD68分子和PD-L1分子在卵巢癌組織中的表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于卵巢良性組織，因此，說明了卵巢癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的高表達(dá)以及PD-L1分子的表達(dá)在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中承擔(dān)著重要的作用。同時(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)PD-L1分子的表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后生存年數(shù)呈負(fù)相關(guān)，因此，說明了PD-L1分子的表達(dá)在卵巢癌預(yù)后及生存方面起著重要的作用。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了CD68和PD-L1等相關(guān)分子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，但是相關(guān)具體的分子機(jī)制尚未清楚，因此，針對(duì)CD68和PD-L1分子的作用還需要更深入的研究。

綜上所述，根據(jù)PD-L1分子在卵巢癌中的表達(dá)及預(yù)后生存的關(guān)系，提示該分子的表達(dá)可以作為判斷卵巢漿液性腺癌患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。