頂空-氣相色譜法測定丁酸梭菌發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量

魏琦麟，向 蓉，袁明貴，彭新宇，康樺華，余丹妮，徐志宏

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，武漢 430070； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣州 510640)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)在厭氧發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一系列的短鏈脂肪酸(SCFAs)，其代謝產(chǎn)物主要為丁酸和丁醇，乙酸和丙酮是副產(chǎn)物，還有少量的乳酸和乙醇產(chǎn)生[1]。丁酸梭菌在腸道內(nèi)定植后，主要代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸和琥珀酸等[2]，90%以上的SCFAs通過質(zhì)子化和陰離子擴散的方式被腸上皮細胞吸收，只有5%～10%被排泄到體外[3]。SCFAs不僅可以降低腸道pH，抑制有害菌的生長，還可以作為腸上皮細胞能量代謝和生長發(fā)育的重要能量來源，維持腸道健康。SCFAs中的丁酸可以作為配體激活特異性G蛋白偶聯(lián)受體，激活腸黏膜免疫活性，在一定程度上起到增強免疫力的作用[4]。因此，丁酸梭菌發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物及其功能作用受到廣泛關(guān)注。

生物樣品中SCFAs的分析方法較多，如氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、毛細管電泳法(CE)[8]和離子排斥色譜法(IC)[9]等。Chen等[10]將人體的血液樣品經(jīng)衍生化處理后，通過液相色譜法測定血液中丁酸和己酸含量，雖然該方法可靠性高，但復(fù)雜的前處理操作，導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性和簡便性較差。CE和IC由于儀器設(shè)備價格昂貴，成本較高，不具有普遍適用性[11-13]。GC具有靈敏度高，分析時間短，無需衍生化處理等優(yōu)點，是測定生物樣品中SCFAs最常用的方法[14]。樣品一般通過有機溶劑萃取后經(jīng)濾膜過濾，再進行GC分析，然而由于生物樣品的復(fù)雜性，雜質(zhì)的存在會污染進樣口和毛細管柱，降低分析的準確性，增加維護成本[15]。頂空進樣器(Headspace sampler，HS)是一種廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中短鏈物質(zhì)的分析方法[16-17]，在測定生物樣品中的短鏈成分時具有獨特的優(yōu)勢，避免了非揮發(fā)性組分對分析造成的干擾，減少了對色譜柱及進樣口的污染[18]，在很大程度上彌補了以上方法的缺陷。本文建立了HS-GC分析丁酸梭菌發(fā)酵液中SCFAs的方法并進行了方法學驗證，以期為生物樣品中SCFAs的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸和2-乙基丁酸均為色譜純，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

島津GC-2010 Plus氣相色譜儀，配備氫火焰離子化檢測器(FID)；HS-10頂空自動進樣器；Rtx-Wax彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

分別精確稱取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸標準品，純水定容，配制成200 mmol/L的乙酸、異丁酸、丁酸標準儲備液，100 mmol/L的丙酸、戊酸和己酸標準儲備液，備用。

分別移取不同體積的標準儲備液，配制成混合標準品溶液，其中，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸的終濃度均為20 mmol/L。將標準品混合溶液用純水梯度稀釋成不同濃度，在各濃度混合標準品溶液中加入內(nèi)標物2-乙基丁酸，使內(nèi)標物濃度均為1 mmol/L。

1.2.2 丁酸梭菌發(fā)酵液的制備

將活化后的丁酸梭菌，按3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃下厭氧培養(yǎng)。每隔2 h取樣，樣液在5 000 r/min、室溫下離心10 min，將上清液與甲酸以100∶1的體積比混合均勻后取1 mL移入頂空進樣瓶中，同時加入內(nèi)標2-乙基丁酸，加蓋密封，待測。

1.2.3 HS-GC分析條件

頂空進樣器條件：恒溫爐溫度70℃，樣品流路溫度90℃，傳輸線溫度110℃；樣品瓶加壓氣壓160.0 kPa，樣品瓶恒溫時間10 min，樣品瓶加壓時間1 min，GC循環(huán)時間22 min。

GC條件：氫氣和空氣流速分別為60 mL/min和400 mL/min，高純度氦氣流速1.67 mL/min；程序升溫為初溫80℃，以10℃/min升溫至200℃，保持1 min，以20℃/min程序升溫至220℃，保持1 min；進樣口溫度220℃；FID檢測器溫度300℃，分流比1∶10。

1.2.4 方法學驗證

1.2.4.1 標準曲線線性回歸方程與檢測范圍確定

取1.2.1中梯度稀釋的標準品溶液，分別進行GC測定。以標準品濃度為橫坐標，不同濃度下標準品的峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線，并進行擬合得線性回歸方程。

1.2.4.2 日內(nèi)精密度及日間精密度考察

日內(nèi)精密度為在同一天內(nèi)，取同一批分析樣品每隔2 h測定1次，每天連續(xù)測定6次。日間精密度為同一樣品連續(xù)3 d進行GC測定分析。通過計算各SCFAs色譜峰的保留時間和峰面積的RSD判斷方法的精密度是否符合要求。

1.2.4.3 穩(wěn)定性考察

將已知濃度的SCFAs混合標準品溶液在4℃下存放，連續(xù)3 d取樣，在室溫下進行GC分析，考察溶液在3 d內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.4.4 樣品加標回收率考察

取20 h發(fā)酵液樣品，測定其中SCFAs濃度后，分別在發(fā)酵液中加入低、中、高3個不同濃度的混合標準品溶液，其中低濃度的加入量為樣品測定濃度的80%，中濃度的加入量與樣品測定濃度相近，高濃度的加入量為樣品測定濃度的120%，按下式計算加標回收率。

加標回收率=(加標試樣測定值-初始量)/加標量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 標準品色譜圖(見圖1)

注：1.乙酸；2.丙酸；3.異丁酸；4.丁酸；5.戊酸；6.2-乙基丁酸；7.己酸。

圖1 混合標準品溶液色譜圖

由圖1可見，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸的保留時間分別為4.840、5.779、6.112、6.800、8.057、9.270 min，內(nèi)標物2-乙基丁酸的保留時間為8.315 min。各SCFAs峰形良好，基線穩(wěn)定，拖尾較小，各組分的分離度較好，內(nèi)標物與其他組分間峰位相近且分離度良好，表明該測定方法可以將待測組分很好地分離，適合SCFAs的分離和鑒定。

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線回歸方程與檢測范圍

按1.2.4.1方法，得到各SCFAs的標準曲線回歸方程，如表1所示。

表1 SCFAs的標準曲線回歸方程、檢測限、定量限

由表1可見，乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和己酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表示在該方法的濃度范圍內(nèi)，各SCFAs標準曲線的線性關(guān)系良好。由信噪比法計算得到檢出限(LOD)范圍為0.01～0.17 mmol/L(S/N>3)，定量限(LOQ)范圍為0.02～0.53 mmol/L(S/N>10)。檢出限與定量限較低，說明該方法可以作為丁酸梭菌發(fā)酵過程中SCFAs含量檢測定量方法使用。

2.2.2 日內(nèi)精密度與日間精密度

按1.2.4.2考察方法的日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果分別如表2、表3所示。

表2 日內(nèi)精密度(n=6)

表3 日間精密度(n=3)

由表2、表3可見，峰面積的日內(nèi)精密度良好，RSD范圍為0.12%～0.93%，3 d內(nèi)各標準品峰面積的日間RSD為1.18%～2.86%，保留時間的日內(nèi)RSD和日間RSD分別為0.01%～0.03%和0.07%～0.45%。說明在試驗期內(nèi)，各SCFAs的出峰時間穩(wěn)定，峰面積變化在誤差允許范圍內(nèi)，有較好的日內(nèi)精密度及日間精密度。

2.2.3 穩(wěn)定性

按照1.2.4.3方法考察樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 標準品穩(wěn)定性

由圖2可見，混合標準品中各SCFAs含量的RSD均在8%以下，表明在該條件下各SCFAs在3 d內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，說明在3 d內(nèi)可使用同一樣品進行試驗。

2.2.4 加標回收率

按1.2.4.4方法考察樣品的加標回收率，結(jié)果如表4所示。

由表4可見，乙酸和丁酸的加標回收率范圍分別在90.14%～108.71%和88.90%～95.36%之間。表明該方法適用于發(fā)酵液樣品中乙酸和丁酸的定量測定。

表4 加標回收率

2.3 樣品分析

丁酸梭菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中隨時間變化產(chǎn)SCFAs情況如圖3和圖4所示。

圖3 48 h內(nèi)乙酸含量變化

圖4 48 h內(nèi)丁酸含量變化

由圖3、圖4可見，應(yīng)用HS-GC在丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基中檢測到乙酸和丁酸兩種SCFAs。接種后的培養(yǎng)基內(nèi)含有少量的乙酸，在0～14 h時，乙酸和丁酸的含量變化緩慢，14 h開始，進入到二者含量變化的對數(shù)期，乙酸和丁酸的含量增加迅速，尤其是丁酸，在15 h左右含量超過了乙酸，成為發(fā)酵液中含量最高的短鏈脂肪酸，在22 h時進入乙酸和丁酸含量的穩(wěn)定期，二者含量分別為10.5 mmol/L和12.5 mmol/L左右，持續(xù)到32 h，有小幅度的增長，最終丁酸和乙酸的含量分別穩(wěn)定在14.1 mmol/L和11.9 mmol/L左右。

2.4 討論

微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的短鏈物質(zhì)種類較多，且含量變化各不相同，增加了分析測定的難度。在SCFAs檢測過程中，易揮發(fā)的性質(zhì)導(dǎo)致樣品定量不準確、重復(fù)性差，同時雜質(zhì)的存在也會影響樣品峰形及基線穩(wěn)定。在相關(guān)文獻報道中，張小菊等[19]采用同時蒸餾萃取法提取了花生粕混合菌發(fā)酵物的短鏈物質(zhì)，并使用帶有普通進樣器的氣相色譜儀進行短鏈物質(zhì)的測定。結(jié)果顯示，經(jīng)過同時蒸餾萃取的短鏈物質(zhì)較少，在樣品中只檢測到少量乙醇，可能的原因是前處理損耗了較多的短鏈成分，另外蒸餾萃取過程中帶有的雜質(zhì)導(dǎo)致峰形較差并且出峰不明顯。吳慧玉[20]使用乙酸乙酯萃取大腸桿菌發(fā)酵液中的SCFAs，建立了氣相色譜分析方法，各SCFAs之間分離度較好，但由于前處理采用有機溶劑萃取法，在前處理過程中無法避免SCFAs的損失，線性相關(guān)系數(shù)未能大于0.999，同時由于采用乙酸乙酯作為萃取劑，氣相色譜分析過程中會出現(xiàn)較強的溶劑峰，在干擾色譜分析準確性的同時，也產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)。本研究中使用的頂空-氣相色譜分析簡化了前處理過程，減少了樣品中SCFAs在前處理過程中的損失，最大程度地保留了原始組分，檢測結(jié)果更加接近樣品中的真實成分，相比于普通進樣分析準確度有所提升，頂空進樣器在避免溶劑峰對分析干擾的同時，也有效減少了有機溶劑對氣相色譜系統(tǒng)的污染，降低了維護成本。檢測結(jié)果也顯示各標品曲線的線性關(guān)系良好，相應(yīng)濃度范圍相關(guān)系數(shù)均大于0.999。方法學驗證顯示本研究建立的方法重復(fù)性好、穩(wěn)定度高。此外，李夢嬌等[21]在對植物油中SCFAs含量分析時所用時間為26 min，Umar[22]對益生菌發(fā)酵產(chǎn)物中SCFAs含量分析所用時間為20.5 min，而使用頂空進樣器進行SCFAs含量的測定，分析時間為16 min，明顯縮短了分析測定總時間，且無需樣品前處理，在大批量、快速檢測應(yīng)用方面具有明顯的優(yōu)勢，適用于發(fā)酵液中SCFAs快速測定。

3 結(jié) 論

采用頂空-氣相色譜法分析丁酸梭菌發(fā)酵液中SCFAs的含量變化，該方法前處理簡單，避免了有機溶劑萃取過程對環(huán)境的污染和對操作人員的危害，色譜峰分離效果好，重復(fù)性好，具有快速、準確和穩(wěn)定性高的特點。所建立的方法適用于丁酸梭菌發(fā)酵過程中SCFAs含量的快速測定。