響應面法優(yōu)化酶法提取鱷魚油工藝研究

董合磊，吳穎峰，劉 佳，馬小宏，肖紅梅

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術研究中心，南京 210095；2.如皋市海宏皮革制品有限公司，江蘇 如皋 226500)

鱷魚是一種古老的肉食性卵生脊椎類兩棲爬行動物，屬爬行綱(Repitilia)、鱷目(Crocodilia)，主要生活在溫帶及熱帶地區(qū)[1]。我國自1993年開始引進、養(yǎng)殖鱷魚。2005年，國家林業(yè)局批準人工養(yǎng)殖尼羅鱷、灣鱷、暹羅鱷3種鱷魚列入首批54種可商業(yè)經(jīng)營利用野生動物名錄。隨著人工養(yǎng)殖技術的日益完善，養(yǎng)殖地域已經(jīng)由南方各省擴大到北京等北部地區(qū), 人工養(yǎng)殖鱷魚規(guī)模不斷擴大，鱷魚養(yǎng)殖量越來越大[2]。然而人工養(yǎng)殖鱷魚依然主要用于鱷魚皮革制品，鱷魚其余部位如血、骨、肉、脂肪等開發(fā)力度不夠，造成了較大的資源浪費，影響了鱷魚業(yè)的健康發(fā)展。

鱷魚內(nèi)臟周圍與尾部肌肉間貯藏大量貯脂，是鱷魚油提取的優(yōu)質(zhì)原材料[2]。鱷魚油已被證實具有防凍傷、抗菌消炎、愈合燒傷疤痕的功效[3-4]，已被用于化妝品與防凍傷等藥品[5]?？茖W研究發(fā)現(xiàn)，鱷魚油脂肪酸多達24種，且不飽和脂肪酸含量較高；鱷魚油中含有EPA和DHA。因此，鱷魚油在保健品方面也有一定的開發(fā)前景。

魚油的生產(chǎn)工藝主要包括蒸煮法、壓榨法、稀堿水解法、酶法和超臨界流體萃取法等。酶法是利用蛋白酶對蛋白質(zhì)進行水解，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而破壞蛋白質(zhì)與脂肪的結(jié)合，使油脂釋放出來。酶法反應條件溫和，所得油脂品質(zhì)較高，并且蛋白酶價格較低，酶解產(chǎn)物還能進一步加工用于飼料工業(yè)[6-12]。目前關于鱷魚油提取工藝研究較少[13-14]，有關酶法提取鱷魚油相關研究更少。

本研究以人工養(yǎng)殖暹羅鱷貯脂為主要原料，采用酶法提取鱷魚油，以提取率為評價指標，利用單因素實驗與響應面法對鱷魚油的提取工藝進行優(yōu)化，同時對鱷魚油進行理化指標和脂肪酸組成分析，以期為鱷魚油工業(yè)化生產(chǎn)及深加工提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鱷魚軀干和尾部，蘇州市奧新鱷魚開發(fā)有限公司泰興分公司提供。堿性蛋白酶(5×104U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)、復合蛋白酶(10×104U/g)、木瓜蛋白酶(10×104U/g)、風味蛋白酶(1.5×104U/g) ，食品級，北京索萊寶科技有限公司提供；其他試劑均為分析純。

JRJ-200型絞肉機；BL-220H分析天平，島津(上海)實驗器材有限公司；磁力攪拌水浴鍋；恒溫水浴鍋；Avanti J-E型高速冷凍離心機，美國Beckman Counter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料前處理

剔取鱷魚軀干和尾部中的貯脂，使用4 mm孔板絞肉機絞碎，將絞碎的鱷魚貯脂糜放入真空包裝袋，-20℃冷凍貯藏備用。

1.2.2 酶法提取鱷魚油工藝流程

冷凍鱷魚貯脂糜→解凍→取20 g鱷魚貯脂糜→按一定料液比加入蒸餾水→加入一定量蛋白酶→水浴攪拌加熱一定時間→90℃水浴滅酶10 min→5 000 r/min離心15 min→稱重→貯藏。

提取率=鱷魚油質(zhì)量/(鱷魚貯脂糜質(zhì)量×鱷魚貯脂中粗脂肪含量)×100%

鱷魚貯脂中粗脂肪含量測定:參照 GB 5009.6—2016，采用索氏抽提法測定其含量為82.6%。

1.2.3 蛋白酶篩選實驗

因為不同的蛋白酶的酶切位點不同，對鱷魚貯脂提取鱷魚油的水解作用也各不相同，需要通過篩選蛋白酶得到最佳的實驗用酶。本實驗選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶和風味蛋白酶作為實驗用酶，并參考各蛋白酶的使用說明確定其最適實驗溫度(見表1)。在該溫度下，固定料液比為1∶1、酶添加量為1%，分別加入5種蛋白酶，酶解3 h，以鱷魚油提取率作為選擇蛋白酶的依據(jù)，同時用空白對照實驗作對比。

表1 蛋白酶最適實驗溫度

1.2.4 鱷魚油理化性質(zhì)的測定

酸價，參照GB 5009.229—2016；過氧化值，參照GB 5009.227—2016；碘值，參照GB/T 5532—2008；水分及揮發(fā)物含量，參照GB 5009.236—2016；不溶性雜質(zhì)，參照GB/T 15688—2008。

1.2.5 脂肪酸組成分析

鱷魚油脂肪酸組成參照GB 5009.168—2016第三法，由江蘇華測品標檢測認證技術有限公司測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)每組重復3次取平均值，圖表采用Excel 2013進行處理繪制，使用SAS 8.0進行單因素方差分析，響應面實驗設計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類的篩選(見圖1)

注：字母不同代表存在顯著性差異(P<0. 05)。

圖1 不同蛋白酶對鱷魚油提取率的影響

由圖1可知，空白組提取率最低，僅為50.22%。加入蛋白酶后，鱷魚油提取率顯著上升。蛋白酶水解能力的不同是因為不同蛋白酶對于肽鍵的專一性有所不同，所以提取率也有一定的差異[12]。實驗結(jié)果表明堿性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶的提取率結(jié)果相近，沒有顯著性差異(P>0.05)。提取率最高的為中性蛋白酶，鱷魚油提取率達到76.02%，且中性蛋白酶價格相比其他酶更低。綜合提取率和經(jīng)濟因素，選擇中性蛋白酶。

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取時間對提取率的影響

以鱷魚貯脂為原料，提取時間分別設定1、2、3、4、5 h 5個水平，其他條件固定為酶添加量1%、料液比 1∶1、提取溫度50℃，研究提取時間對鱷魚油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對鱷魚油提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，鱷魚油提取率不斷升高，超過3 h后，鱷魚油提取率略微下降，總體趨勢平緩，這與衣美艷[6]、陸劍鋒[8]等的研究結(jié)果一致。提取時間過長可能會使得鱷魚油的品質(zhì)降低，因為鱷魚油中含有大量不飽和脂肪酸，暴露在空氣中時間越長，會造成鱷魚油中不飽和脂肪酸氧化，使鱷魚油色澤加深。因此，選擇最適的提取時間為3 h。

2.2.2 料液比對提取率的影響

以鱷魚貯脂為原料，料液比分別設定1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2.5個水平，其他條件固定為酶添加量1%、提取溫度50℃、提取時間3 h，研究料液比對鱷魚油提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對鱷魚油提取率的影響

由圖3可知，當不加水時，鱷魚油提取率最低，這是因為不加水時，底物與酶接觸不均勻，酶反應不充分。當料液比為1∶0.5時，鱷魚油提取率最大。當料液比繼續(xù)增大，鱷魚油提取率越來越低，這是因為加水過多之后，酶分子和原料的接觸概率降低，鱷魚油提取率下降。因此，選擇最適的料液比為1∶0.5。

2.2.3 酶添加量對提取率的影響

以鱷魚貯脂為原料，酶添加量分別設定0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25% 5個水平，其他條件固定為提取時間3 h、料液比1∶0.5、提取溫度50℃，研究酶添加量對鱷魚油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶添加量對鱷魚油提取率的影響

由圖4可知，鱷魚油提取率隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與李夢凡[10]、陶軼松[11]等研究結(jié)果相近。當酶添加量為0.5%時，鱷魚油提取率最高，隨后逐漸降低，可能原因是酶添加量過高會使酶相互影響，使得酶對底物的水解作用降低。同時從成本方面考慮，選擇最適的酶添加量為0.5%。

2.2.4 提取溫度對提取率的影響

以鱷魚貯脂為原料，提取溫度分別設定40、45、50、55、60℃ 5個水平，其他條件固定為提取時間3 h、料液比1∶0.5、酶添加量0.5%，研究提取溫度對鱷魚油提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對鱷魚油提取率的影響

由圖5可知，鱷魚油提取率隨著提取溫度的升高而升高，提取溫度較低時，鱷魚貯脂無法完全酶解，提取率較低。當提取溫度達到55℃時鱷魚油提取率最高，之后隨著提取溫度升高鱷魚油提取率降低。因為酶促反應容易受到溫度的影響，且原理十分復雜，升高溫度可能會加速分子的運動，也會對酶活性、底物和反應速度產(chǎn)生一定影響[15]。因此，選擇最適提取溫度為55℃。

2.3 響應面優(yōu)化實驗

2.3.1 響應面實驗設計及結(jié)果

在單因素實驗基礎上，將提取時間固定為3 h，以提取溫度(A)、料液比(B)、酶添加量(C)為因素，鱷魚油提取率(Y)為指標，采用響應面實驗確定酶法提取鱷魚油的最優(yōu)工藝條件。響應面實驗因素水平編碼見表2，響應面實驗設計及結(jié)果見表3，方差分析如表4所示。

表2 響應面實驗因素水平編碼

表3 響應面實驗設計及結(jié)果

通過Design-Expert 軟件對表3中得到的鱷魚油提取率數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程為∶Y=87.36-1.94A-0.49B-2.50C+1.39AB+2.21AC+0.14BC-8.76A2-4.99B2-1.73C2。

表4 方差分析

注：*為差異顯著 (P<0.05);**為差異極顯著(P<0.01) 。

2.3.2 驗證實驗

通過該模型可以得到鱷魚油最佳提取工藝條件為提取溫度53.86℃、料液比1∶0.45、酶添加量0.28%，在此條件下鱷魚油提取率為88.69%。為了實際工藝的方便，設置提取溫度54℃、料液比1∶0.45、酶添加量0.3%，進行3次平行實驗，鱷魚油提取率的平均值為87.42%，與預測值基本相符。可見，該模型能夠很好地預測酶法提取鱷魚油的提取率，對鱷魚油的實際工業(yè)生產(chǎn)具有一定參考價值。

2.4 鱷魚油的理化性質(zhì)(見表5)

表5 酶法提取鱷魚油的理化性質(zhì)

由表5可知：最佳工藝條件下提取的鱷魚油呈淺黃色，略渾濁，具有鱷魚油的特殊風味；鱷魚油的酸價、過氧化值等指標都達到SC/T 3502—2016中一級粗魚油標準；碘值(I)為148.47 g/100 g，可知鱷魚油中不飽和脂肪酸含量豐富；不溶性雜質(zhì)為0.45%，接近標準值，因為酶法提取過程中會產(chǎn)生一些蛋白質(zhì)、膽固醇及色素等非油脂成分，這些雜質(zhì)成分不僅會影響鱷魚油的穩(wěn)定性，也會影響鱷魚油的進一步加工利用，因此可以通過進一步的精煉工藝提高鱷魚油的質(zhì)量，達到商業(yè)或者工業(yè)的目的。

2.5 鱷魚油的脂肪酸組成(見表6)

表6 酶法提取鱷魚油脂肪酸組成及相對含量 %

由表6可知，鱷魚油中共檢出32種脂肪酸，主要由C10～C24脂肪酸組成。鱷魚油中飽和脂肪酸(SFA)含量為40.96%，主要為棕櫚酸。不飽和脂肪酸(UFA)含量為58.57%，其中單不飽和脂肪酸(MUFA)占39.50%，主要為油酸，多不飽和脂肪酸(PUFA)占19.07%，主要為亞油酸，EPA與DHA總量為2.42%。酶法提取鱷魚油的脂肪酸種類及EPA與DHA的含量均高于林珈好等[13]使用超臨界CO2流體萃取法和干法熬制提取的鱷魚油和李慧等[14]使用淡堿水解法提取的鱷魚油，可能原因是提取方法或者原料不同影響鱷魚油脂肪酸組成。鱷魚油不飽和脂肪酸含量豐富，脂肪酸組成合理，屬于優(yōu)質(zhì)的動物油脂。

3 結(jié) 論

以鱷魚貯脂為原料，采用單因素實驗結(jié)合響應面法對酶法提取鱷魚油工藝條件進行優(yōu)化，獲得的鱷魚油最佳提取工藝條件為中性蛋白酶添加量0.3%、料液比1∶0.45、提取溫度54℃、提取時間3 h，在此條件下鱷魚油提取率為87.42%。所得鱷魚油產(chǎn)品外觀呈淺黃色，略渾濁，具有鱷魚油特殊風味，無酸敗味，酸價、過氧化值等達到SC/T 3502—2016一級粗魚油標準。鱷魚油含有32種脂肪酸，其中飽和脂肪酸含量為40.96%，不飽和脂肪酸含量為58.57%，EPA和DHA總量為2.42%，表明鱷魚油是一種具有較高營養(yǎng)品質(zhì)的油脂。