抗體聯(lián)合親和力檢測(cè)診斷巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染的臨床研究

劉 力 羅茜茜 張敬蕊 普曉瑜

(石家莊市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊050000)

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是胎兒宮內(nèi)感染最常見(jiàn)的病毒，一般只引起亞臨床感染和潛伏感染。當(dāng)孕婦患有巨細(xì)胞活動(dòng)感染時(shí)，病毒可通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)引起先天性感染。孕婦原發(fā)感染引起宮內(nèi)感染的幾率為24%～75%，非原發(fā)感染引起宮內(nèi)感染的幾率為0.15%～2.0%[1]。發(fā)生宮內(nèi)感染的胎兒10%～15%出生有癥狀，多數(shù)可出現(xiàn)發(fā)育遲緩、 肝脾腫大、小頭畸形、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、血小板減少、貧血等癥狀，特別引起嬰兒的巨細(xì)胞包涵體病，患兒可多個(gè)系統(tǒng)多個(gè)器官受損。85%～90%出生無(wú)癥狀，但約10%～15%可能發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)耳聾，精神運(yùn)動(dòng)疾病等[2,3]。一般選擇HCMV特異性IgM和IgG抗體聯(lián)合應(yīng)用來(lái)診斷是否感染及感染類型。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用新型HCMV-IgG親和力ELISA解離法檢測(cè)試劑盒，開(kāi)展HCMV-IgG親和力檢測(cè)，必將為感染診斷提供更加有力的幫助。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 選擇2016年1月～2017年11月在我院行巨細(xì)胞病毒感染篩查，結(jié)果為血清IgM抗體和IgG抗體雙陽(yáng)性的孕婦130例，無(wú)典型的感染癥狀，平均年齡(26.7±6.5)歲，其中8～16周孕婦123例，20周后的孕婦7例。入組孕婦空腹采集促凝血4 ml，離心分離血清備用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)石家莊第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者知情同意。

1.1.2試劑和儀器 人巨細(xì)胞病毒IgM和IgG檢測(cè)試劑及IgG親和力檢測(cè)試劑盒及儀器均來(lái)自于鄭州安圖生物公司。巨細(xì)胞核酸檢測(cè)采用美國(guó)生產(chǎn)的ABI7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，試劑由廣州達(dá)安提供。

1.2方法

1.2.1人巨細(xì)胞病毒IgM和IgG檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光法，廠家配套高低值質(zhì)控品同步檢測(cè)?；覅^(qū)判斷值分別為IgM 8～12 AU/ml；IgG 10～14 AU/ml。大于此范圍即為陽(yáng)性。

1.2.2巨細(xì)胞病毒IgG親和力檢測(cè)方法 包被HCMV抗原的96孔酶標(biāo)板，分別加入低親和力質(zhì)控品、高親和力質(zhì)控品、稀釋(1∶100)后待測(cè)樣品100 μl/孔，各2孔，37℃溫浴30 min，洗板6次后，一孔加入解離緩沖液，一孔加入對(duì)照緩沖液各100 μl，37℃溫浴10 min，同上洗板后加入酶結(jié)合物100 μl，37℃溫浴30 min，洗板后加入底物液和顯色劑各50 μl，37℃避光10 min，加入終止液，混勻，檢測(cè)吸光值，兩孔比值為親和力指數(shù)(Avidity index,AI)。

1.2.3巨細(xì)胞病毒核酸檢測(cè) PCR方法檢測(cè)130位孕婦尿中HCMV-DNA含量，并對(duì)HCMV-DNA拷貝大于閾值的孕婦，隨訪產(chǎn)后胎兒狀況，分別留取胎兒尿液、血液各一份，血液進(jìn)行人巨細(xì)胞的IgM檢測(cè)，尿液進(jìn)行核酸定量檢測(cè)。檢測(cè)閾值為2 000拷貝/ml。

2 結(jié)果

102例(孕8～16周)血清樣本親和力指數(shù)>50%，判為高親和力。HCMV-DNA均小于2 000拷貝/ml。胎兒均無(wú)不良結(jié)局。對(duì)低親和力和灰區(qū)親和力孕婦隨訪，以了解新生兒感染情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，11例(孕8～16周7例，孕20周以上的4例)血清樣本為親和力指數(shù)在45%～50%，判為灰區(qū)，其中1例HCMV-DNA(孕28周)陽(yáng)性，隨訪檢測(cè)胎兒出生后尿液HCMV-DNA大于2 000拷貝/ml，血清巨細(xì)胞病毒IgM抗體陽(yáng)性，診斷為先天性HCMV感染。17例(孕8～16周14例，孕20周以上的3例)

表1 入組孕婦巨細(xì)胞病毒IgG親和力指數(shù)與不良結(jié)局

Tab.1 Cytomegalovirus IgG affinity index and adverse outcome in pregnant women group

Groupsn(%)DNA positiverateAdverse outcomesrateA group(AI>50%)102(78.46%)0(0)0(0)B group(45%≤AI≤50%)11(8.46%)1(0.77%)1(0.77%)C group(AI<45%)17(13.07%)7(5.38%)2(1.54%)

血清樣本親和力指數(shù)<45%，判為低親和力，HCMV-DNA陽(yáng)性7例。其中，胎兒出生后尿液HCMV-DNA大于2 000拷貝/ml 1例，血清巨細(xì)胞病毒IgM抗體陽(yáng)性，診斷為先天性HCMV感染1例，流產(chǎn)1例。表1為AI結(jié)果與百分比。

3 討論

IgM抗體被認(rèn)為是近期或原發(fā)感染的指標(biāo)。但是IgM抗體持續(xù)6～9個(gè)月陽(yáng)性情況時(shí)有發(fā)生,實(shí)驗(yàn)室方法學(xué)也會(huì)有非特異性假陽(yáng)性問(wèn)題存在，臨床醫(yī)生很難推斷是否真正感染以及感染時(shí)期。雖然可檢測(cè)尿液中人巨細(xì)胞病毒核酸，但當(dāng)前核酸陰性并不能排除前期感染的可能。

抗體親和力是抗體的結(jié)合部位與相應(yīng)抗原決定簇之間的非共價(jià)引力與斥力之和。親和力檢測(cè)可用于鑒別原發(fā)(近期)感染和復(fù)發(fā)(既往)感染。全軍計(jì)劃生育優(yōu)生優(yōu)育技術(shù)研究所發(fā)布的《妊娠期TORCH篩查指南》中建議HCMV-IgM和HCMV-IgG親和力聯(lián)合檢測(cè)，可以確定妊娠婦女的感染診斷[4]。在妊娠16 周前檢測(cè)抗體親和力為高親和力指數(shù)則是既往感染的良好指標(biāo)[4]。人接觸CMV抗原后，產(chǎn)生抗體親和力隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，IgG抗體親和力低說(shuō)明為近期原發(fā)性CMV感染，抗體親和力高說(shuō)明感染發(fā)生在較長(zhǎng)時(shí)間以前。感染后3個(gè)月內(nèi)的血清樣本HCMV-IgG親和力指數(shù)一般為(21±13)%，既往感染的親和力指數(shù)一般為(78±10)%[5]。有報(bào)道顯示在妊娠16～18周之前檢測(cè)HCMV-IgG親和力指數(shù)，診斷胎兒感染的敏感度為100%，20周以后則迅速降為62.5%，因此 ，妊娠12～16周檢測(cè)出高IgG抗體親和力指數(shù)是診斷既往感染較好的指標(biāo)[6]，對(duì)后續(xù)開(kāi)展產(chǎn)前診斷更有參考意義。

在本文結(jié)果中A組標(biāo)本均為孕8～16周的孕婦，AI>50%，提示孕前既往感染，胎兒無(wú)不良結(jié)局。在C組標(biāo)本中AI<45%提示近期感染，胎兒不良結(jié)局率較高達(dá)到1.54%，說(shuō)明病毒感染通過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)較高。而在B組標(biāo)本中有1例胎兒診斷為先天性CMV感染，標(biāo)本為產(chǎn)婦孕28周時(shí)采集，不能排除是否原發(fā)感染，因此在孕早期進(jìn)行TOUCH的篩查是非常重要的。

IgG親和力檢測(cè)判斷感染類型雖早有報(bào)道，但是由于方法學(xué)差異，試劑優(yōu)劣，判斷標(biāo)準(zhǔn)也有很大差別。之前國(guó)內(nèi)多采用尿素變性的方法檢測(cè)親和力，方法繁瑣，特異性差。本文采用的ELISA方法檢測(cè)IgG親和力實(shí)驗(yàn)更便捷，結(jié)果更可靠。

綜上所述，巨細(xì)胞抗體IgM檢測(cè)方法多采用酶免法，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多，如RF干擾、交叉反應(yīng)、多克隆刺激等。而對(duì)于親和力的檢測(cè)，明確判斷高親和力和低親和力的同時(shí)，可以有灰區(qū)的情況存在。建議2周后再?gòu)?fù)查[4]，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清IgM和IgG抗體的變化，并結(jié)合孕婦孕周、臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)病史及產(chǎn)前診斷技術(shù)綜合評(píng)估感染風(fēng)險(xiǎn)，多指標(biāo)多方法綜合應(yīng)用，才能更好地判斷孕婦感染時(shí)期。