連翹苷對糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究①

冷 偉 劉春瑩 尚 乘 陳明霞

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,咸陽712000)

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)截至2015年，全球約有4.15億糖尿病患者，其中90%以上為2型糖尿病，推測每年有150～500萬人因糖尿病死亡，而糖尿病腎病是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。在1型糖尿病中糖尿病腎病的發(fā)病率為33%～40%，而2型糖尿病中發(fā)病率為20%～25%[2]。因此延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展具有重要的意義。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制與糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)和血流動(dòng)力學(xué)異常等因素密切相關(guān)[3]。因此天然降血糖血脂、抗氧化化合物可以作為治療糖尿病腎病的候選藥物[4]。連翹苷是植物連翹干燥果實(shí)中的提取物，在生活中常用于清熱解毒、風(fēng)熱感冒的治療。研究發(fā)現(xiàn)連翹苷具有抑制炎癥反應(yīng)、抗病毒、抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種藥理學(xué)作用[5,6]。Kong等[7]實(shí)驗(yàn)顯示，連翹苷能抑制腫瘤壞死因子的激活，改善肥胖組織的炎癥變化和胰島素抵抗性。據(jù)報(bào)道，連翹苷能抑制高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪積累，是腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活劑，具有預(yù)防和治療肥胖的作用[8]。然而連翹苷對糖尿病腎病腎組織是否具有保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討連翹苷對糖尿病腎病腎損傷的保護(hù)作用，為連翹苷在糖尿病腎病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 連翹苷(純度>98%，CAS：478-41-2)購自四川維克奇生物公司；SD大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；蘇木伊紅染色試劑盒(HE)購自杭州昊鑫生物公司；大鼠尿白蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自上?？ㄅ锕?；大鼠IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1 ELISA試劑盒購自武漢艾美捷科技公司；免疫組化試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗體TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin購自美國Abcam公司；SOD、CAT、GPx、MDA、GSSG、GSH檢測試劑盒購自碧云天生物。

1.2方法

1.2.1糖尿病腎病大鼠模型的復(fù)制 大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，以高糖高脂飼料(10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、67.5%常規(guī)飼料)飼養(yǎng)1個(gè)月，誘導(dǎo)出胰島素抵抗。腹腔注射25 mg/kg鏈脲佐菌素，72 h后空腹?fàn)顟B(tài)下大鼠血糖濃度高于16.7 mmol/L為造模成功。

1.2.2大鼠的分組及給藥 將糖尿病腎病大鼠隨機(jī)分為4組：糖尿病腎病組，連翹苷5 mg/kg組，連翹苷10 mg/kg組，連翹苷20 mg/kg組，另外設(shè)置正常對照組。造模成功后1 d，連翹苷5、10、20 mg/kg組大鼠采用灌胃給藥的方式給予連翹苷；糖尿病腎病組大鼠給予等量生理鹽水。每天1次，連續(xù)2周后，檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.3蘇木伊紅染色 SD大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，用生理鹽水灌洗至腎臟變白。摘取腎臟液氮速凍后置于-80℃保存。取大鼠腎組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟后，梯度降低的乙醇脫二甲苯，蘇木伊紅染色3 min，自來水洗1 min，1%氨水返藍(lán)，自來水洗1 min。95%乙醇1 min，伊紅染色30 s，80%乙醇脫水30 s，90%乙醇脫水30 s，95%乙醇脫水1 min，無水乙醇脫水1 min，二甲苯2 min后，更換新二甲苯2 min；中性樹脂封片。倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4生化指標(biāo)的檢測 收集24 h尿液，4 000 g離心10 min，按照試劑盒說明書檢測尿白蛋白的含量。

大鼠麻醉后，眼眶取血，室溫靜置2 h，離心收集上清，使用全自動(dòng)生化儀檢測血液尿素氮、尿素、肌酐的含量。取大鼠腎組織，預(yù)冷PBS洗3次，使用眼科剪剪碎后，低溫勻漿，16 000 g離心10 min后，收集上清液。使用領(lǐng)聯(lián)茴香胺核黃素光化學(xué)反應(yīng)法檢測大鼠腎組織中總SOD的活性；采用還原型谷胱甘肽消耗法檢測大鼠腎組織中GPx的活性；使用過氧化氫分解法檢測大鼠腎組織中CAT的活性；MDA采用硫代硫酸鈉法檢測；按照試劑說明書檢測大鼠腎組織中GSH和GSSG的含量。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測大鼠腎組織中炎癥因子的含量 取大鼠腎組織，預(yù)冷PBS洗3次，使用眼科剪剪碎后，低溫勻漿，16 000 g離心10 min后，收集上清液，生理鹽水稀釋后備用。取100 μl樣品至反應(yīng)孔，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)樣品孔和空白孔，加檢測抗體，37℃孵育90 min，洗滌液洗5次，生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，37℃溫育30 min，洗滌液洗5次；加顯色液，37℃避光反應(yīng)15 min，加終止液，檢測波長450 nm處吸收值。每個(gè)標(biāo)本測3個(gè)復(fù)孔，測定值為3個(gè)復(fù)孔的平均值。

1.2.6免疫組化 取石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%過氧化氫于室溫下孵育10 min；切片置于盛枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，95℃左右持續(xù)10 min后室溫冷卻；PBS洗3次，5%BSA封閉液37℃孵育30 min；滴加一抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次；加生物素標(biāo)記的抗體，37℃孵育30 min；PBS洗3 次，加SABC，37℃孵育30 min；PBS洗3次，顯微鏡下顯色并控制反應(yīng)時(shí)間，蘇木素復(fù)染后脫水透明，中性樹膠封片。使用軟件Image J分析陽性細(xì)胞占比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組腎小球上皮細(xì)胞排列整齊；糖尿病腎病組腎小球體積增大，系膜區(qū)彌漫性增寬，細(xì)胞外基質(zhì)增多，基底膜增厚，腎間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤。連翹苷治療后，腎小球的體積，基底膜厚度和炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。

2.2連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎功能指標(biāo)的影響 糖尿病腎病組與對照組相比，血液中尿素氮、肌酐、尿酸和24 h尿液中尿白蛋白的含量顯著增加；糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷作用后，結(jié)果顯示尿血液中尿素氮、肌酐、尿酸和24 h尿液中尿白蛋白的含量顯著減少，作用效果具有連翹苷劑量依賴效應(yīng)，見圖2。

2.3連翹苷對糖尿病腎病大鼠炎癥反應(yīng)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病腎病組與對照組相比，腎組織中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量顯著升高；糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷作用后，腎組織中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量顯著降低，且作用效果具有連翹苷劑量依賴效應(yīng)，見圖3。

圖1 蘇木伊紅染色檢測連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷(×200)Fig.1 Effects of phillyrin on damage of forsythia glycos-ide to renal tissue in diabetic nephropathy rats was detected by hematoxylin and eosin staining(×200)

圖2 連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎功能指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of phillyrin on renal function in diabetic nephropathy ratsNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

圖3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測連翹苷對糖尿病腎病大鼠炎癥因子的影響Fig.3 Effect of forsythia glycoside on inflammatory factors in diabetic nephropathy rats was examined by enzyme-linked immunosorbent assayNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

圖4 免疫組化檢測連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin蛋白表達(dá)水平的影響(×400)Fig.4 Immunohistochemistry was used to determine effect of phillyrin on expression level of TGF-β1,Col-Ⅳ,Fibronectin related proteins in renal tissue of diabetic nephropathy rats(×400)Note: Compared with ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

圖5 連翹苷對糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of phillyrin on oxidative stress in diabetic nephropathy ratsNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

2.4連翹苷對糖尿病腎病大鼠TGF-β1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病腎病組與對照組相比，腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達(dá)水平顯著升高；糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷處理后，腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低，且其作用效果具有連翹苷劑量依賴效應(yīng)，見圖4。

2.5連翹苷對糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，糖尿病腎病組大鼠腎組織中總SOD、CAT、GPx的活性均顯著降低，MDA、GSSG的含量顯著增加，GSH的含量顯著降低；糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷作用后，腎組織中總SOD、CAT、GPx的活性均顯著升高，MDA、GSSG的含量顯著降低，GSH的含量顯著升高，且其作用效果具有連翹苷劑量依賴效應(yīng)，見圖5。

3 討論

隨著生活質(zhì)量的提高，我國糖尿病的發(fā)病率呈上升的趨勢。糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，目前治療效果只能在一定程度上控制其發(fā)展，緩解腎功能衰竭。研究發(fā)現(xiàn)降血壓、降血脂、抗血液凝聚藥物和抗氧化劑對糖尿病腎病患者腎臟具有保護(hù)作用[3]。許多重要提取物具有降血糖血脂和抗氧化等作用，Bo等[9]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制脂質(zhì)累積和氧化應(yīng)激，對糖尿病腎病具有保護(hù)作用。連翹苷有抑制脂肪累積和抑制炎癥反應(yīng)的作用，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)通過高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠模型，探討連翹苷對DN大鼠腎臟的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示連翹苷能有效緩解DN大鼠腎組織病理損傷，糖尿病腎病腎組織損傷與多種因素密切相關(guān)，如血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的變化等。接下來從上述因素中探討連翹苷對DN大鼠中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等因素的影響。

糖尿病腎病是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，典型的癥狀有尿白蛋白含量逐漸上升。本研究顯示，連翹苷治療糖尿病腎病大鼠后，大鼠血液中尿素氮、肌酐、尿酸的含量均顯著降低。尿酸是體內(nèi)嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，由腎臟排出，反映腎功能；肌酐反映腎臟的濾過能力；尿素氮也是腎功能觀測指標(biāo)。腎小球和腎小管發(fā)生病變時(shí)，會出現(xiàn)尿白蛋白含量增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連翹苷緩解糖尿病對大鼠腎功能的影響。

炎癥反應(yīng)在DN的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹苷處理DN大鼠后，大鼠腎組織中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量顯著降低。MCP-1是趨化因子家族中的重要成員，參與細(xì)胞外基質(zhì)積累，能激活核因子κB刺激炎癥因子的釋放[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和IL-18促使腎組織腎小球基底膜增厚，增加血管的通透性。據(jù)報(bào)道，連翹苷通過抑制核因子κB的活性，緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的炎癥反應(yīng)[11]。Yang等[12]在斑馬魚中也發(fā)現(xiàn)連翹苷具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，表明連翹苷抑制糖尿病腎病大鼠的炎癥反應(yīng)。

TGF-β可以由多種細(xì)胞分泌，參與細(xì)胞生長、分化、免疫功能、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等過程的調(diào)節(jié)，TGF-β三種亞型中TGF-β1對糖尿病并發(fā)癥起主要的調(diào)節(jié)作用。在糖尿病患者和糖尿病動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)水平上調(diào)；臨床研究顯示抗TGF-β1抗體對糖尿病腎病患者有治療作用[13]。本文研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病大鼠中TGF-β1的表達(dá)水平明顯高于對照組；糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷處理后，大鼠腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低。Col-Ⅳ、Fibronectin是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)的積累是促進(jìn)腎小球肥大的主要因素[14]。研究發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1的表達(dá)能有效抑制Col-Ⅳ、Fibronectin的積累。Wang等[15]實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，抑制TGF-β1通路能改善糖尿病腎病。連翹苷抑制DN大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)水平，提示其作用與TGF-β1表達(dá)變化相關(guān)，而連翹苷具體的作用機(jī)制仍需要深入研究。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到有害刺激時(shí)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡。研究發(fā)現(xiàn)血糖含量過高后，使ROS的含量上升，破壞腎小球基底膜的極性使腎小球?yàn)V過性遭破壞，另外通過改變血流動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展[16]。本研究顯示，糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷處理后，腎組織總SOD、CAT、GPx的活性均顯著升高，MDA、GSSG的含量顯著降低，GSH的含量顯著升高。SOD、CAT和GPx是抗氧化、清除氧自由基的關(guān)鍵蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，連翹苷能抑制過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC12的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞具有保護(hù)作用[5]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明連翹苷抑制糖尿病腎病大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

糖尿病腎病大鼠經(jīng)連翹苷處理后，腎組織病變明顯緩解，腎功能有效提高，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯緩解，大鼠腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達(dá)水平顯著降低。綜上所述，連翹苷對糖尿病腎病大鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制TGF-β1的表達(dá)相關(guān)。