類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中Bregs細(xì)胞、IL-10和TGF-β的變化及其內(nèi)在關(guān)系①

杜文靜 羅 莉 孟 巖 吉 鵬 董旭南

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，烏魯木齊830000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種T細(xì)胞和B細(xì)胞參與的以滑膜炎為主的全身性免疫性疾病，其具體致病機(jī)制還不清楚[1,2]。RA不僅會(huì)導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)出現(xiàn)病變，還會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)周?chē)慕M織造成損傷。尋找RA發(fā)生發(fā)展的相關(guān)指標(biāo)具有重要的臨床意義[3]，已有證據(jù)表明調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Regulatory B cells,Bregs)和IL-17、IL-10等炎癥因子在RA中發(fā)揮重要的作用[4]。

Breg細(xì)胞是一類(lèi)具有特殊功能的B細(xì)胞亞群，它們參與免疫應(yīng)答和抑制免疫反應(yīng)。Bregs能夠通過(guò)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性的細(xì)胞因子(如IL-10和TGF-β) 或者直接與病原性的T細(xì)胞相互作用抑制免疫反應(yīng)的B細(xì)胞，其已成為免疫調(diào)節(jié)中研究熱點(diǎn)之一。Breg細(xì)胞具有較大的異質(zhì)性。其中有一類(lèi)CD1dhighCD5+CD19high的Breg細(xì)胞，主要分布于脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及成年鼠的腹腔內(nèi)，能產(chǎn)生IL-10，被命名為B10細(xì)胞[5]。 同時(shí)，還有研究表明Breg不僅在RA中發(fā)揮重要作用，還在諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和原發(fā)性干燥綜合征等自身免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用[6,7]。

細(xì)胞因子在疾病發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其中IL-10及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor,TGF-β)為主要的致炎細(xì)胞因子，可作用于多種免疫細(xì)胞，通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞。IL-10為主要的抗炎細(xì)胞因子，可減輕關(guān)節(jié)腫脹，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改善軟骨退化[8,9]。體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)IL-10刺激B細(xì)胞活化，并將活化后的B 細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至糖尿病小鼠模型內(nèi)，可抑制免疫反應(yīng)并減緩病程的發(fā)展[10]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)IL-10缺陷小鼠在感染寄生蟲(chóng)后Breg細(xì)胞仍能夠抑制炎癥反應(yīng)，證明Bregs不僅僅通過(guò)IL-10來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)控作用[11]，后來(lái)證實(shí)Breg的調(diào)控作用還和TNF-β等其他細(xì)胞因子有關(guān)。

本研究旨在研究Bregs細(xì)胞在RA疾病中的可能作用機(jī)制，探討IL-10和TGF-β在CIA小鼠模型中的變化及其同Bregs細(xì)胞比例的內(nèi)在聯(lián)系，這可為RA疾病的預(yù)防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 Ⅱ型膠原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol、Primescript RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；SYBR green Tag qPCR mix購(gòu)自美國(guó)Roche公司；流式細(xì)胞小球微陣列試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)所用FITC-CD1d抗體、PE-CD5抗體和APC-CD19抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠動(dòng)物模型的建立 20 只Wistar雄性小鼠，隨機(jī)分為2組，對(duì)照組和CIA組各10 只。CIA組將充分乳化的0.2 mlⅡ型膠原乳劑(200 μg)注射到小鼠的足跖部皮下，初次免疫一側(cè)注入Ⅱ型膠原乳劑；7天后用同樣方法2次免疫，另一側(cè)一次性注入Ⅱ型膠原乳劑0.2 ml。對(duì)照組小鼠右后足趾皮內(nèi)注射生理鹽水。同時(shí)，用游標(biāo)卡尺記錄小鼠左后足踝關(guān)節(jié)的上下徑。每天觀察并記錄小鼠的生命體征、飲食、活動(dòng)及關(guān)節(jié)變化情況，并對(duì)關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評(píng)分和統(tǒng)計(jì)。具體的小鼠動(dòng)物評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分表示沒(méi)有腫脹；1分表示指關(guān)節(jié)腫脹或出現(xiàn)紅點(diǎn)；2分表示腕或踝關(guān)節(jié)輕微腫脹；3分表示整個(gè)腳爪重度腫脹；4分表示畸形或關(guān)節(jié)僵硬。最后，將每個(gè)腳爪的分?jǐn)?shù)相加，每只小鼠最高評(píng)分為16分。每組的發(fā)病率為腳爪發(fā)生病變的小鼠只數(shù)除以該組小鼠總數(shù)的百分比。

1.2.2蘇木精-伊紅(HE)染色觀察細(xì)胞變化 用10%福爾馬林固定小鼠滑膜組織，并用不同濃度的酒精脫水，用二甲苯進(jìn)行透明處理后進(jìn)行石蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片(5～8 μm)。放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45℃恒溫箱中烘干。依次用二甲苯脫蠟、酒精進(jìn)行至水和蘇木精和伊紅染色操作。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)IL-10和TGF-β mRNA的表達(dá)水平 根據(jù)說(shuō)明書(shū)，用TRIzol方法從冷凍組織中提取總RNA，并使用PrimeScript RT-PCR試劑盒(Thermo)制備cDNA。β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)對(duì)照。用Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀，采用SYBR預(yù)混 Taq (Roche) 酶對(duì)cDNA進(jìn)行定量分析。所有組別均進(jìn)行3次重復(fù)，并使用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4流式細(xì)胞小球微陣列(Cytokine bead array, CBA)技術(shù)檢測(cè)IL-10和TGF-β含量 將待測(cè)血清與試劑盒中帶有IL-10和TGF-β抗體的微珠(beads)進(jìn)行混合，并按說(shuō)明書(shū)操作稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。充分混勻后室溫避光孵育2 h，加入1 ml清洗液洗1次，最后加入300 μl緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Breg細(xì)胞比例變化 取對(duì)照組和CIA組小鼠脾臟，經(jīng)過(guò)研磨破碎分離脾臟細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，取50 μl細(xì)胞懸液分別加入0.2 μl抗體，室溫孵育2 h, 后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Breg細(xì)胞水平。

2 結(jié)果

2.1CIA組與對(duì)照組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分比較 對(duì)照組足爪關(guān)節(jié)無(wú)紅腫；模型組小鼠足跖部出現(xiàn)腫脹，關(guān)節(jié)明顯紅腫增粗，活動(dòng)受限(圖1)。模型組與對(duì)照組關(guān)節(jié)炎評(píng)分比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 1)。

2.2CIA組與對(duì)照組關(guān)節(jié)滑膜HE染色比較 對(duì)照組小鼠滑膜層由 1～2 層滑膜細(xì)胞組成，細(xì)胞排列整齊，無(wú)增生，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；CIA造模組，滑膜層排列不整齊，有 3～5 層明顯增生，水腫，有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)新生血管(圖2)。同時(shí)，CIA組滑膜組織中IL-10和TGF-β的表達(dá)量均高于正常組(圖3)。

2.3CIA組與對(duì)照組IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)的結(jié)果 與對(duì)照組小鼠滑膜組織中IL-10 mRNA及TGF-β mRNA的表達(dá)水平相比較，CIA造模組小鼠滑膜組織中IL-10 mRNA及TGF-β mRNA的表達(dá)水平分別為2.95±0.65，2.89±0.63；CIA組小鼠滑膜內(nèi)IL-10及TGF-β mRNA高表達(dá)，且兩組中IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖1 小鼠關(guān)節(jié)炎情況Fig.1 Evaluation of arthritis severity in CIA model

表1 對(duì)照組與CIA組比較

Tab.1 Disease score in control group and CIA grou

GroupsWeight(g)ThicknessErythemaand SwellingLimitationof motionScoreControl group15.6±2.10000CIA group15.9±2.33.6±0.61)3.7±0.51)1.8±0.91)12.3±1.81)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖2 小鼠關(guān)節(jié)滑膜HE染色(×400)Fig.2 HE staining of mice synovial tissue of joint (×400)

2.4CBA法測(cè)定CIA組與對(duì)照組血清中IL-10、TGF-β的含量比較 對(duì)照組相比，CIA組中IL-10、TGF-β血清中含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.5CIA組與對(duì)照組流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果比較 以CD1dhighCD5+CD19high定義小鼠Breg細(xì)胞。在正常小鼠脾臟中，對(duì)照組Breg細(xì)胞占的總比例為(12.98±0.93)%，CIA造模小鼠脾臟中Breg細(xì)胞占的總比例為(20.88±2.17)% (圖5)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明CIA組小鼠脾臟中Breg細(xì)胞細(xì)胞數(shù)增多。

圖3 對(duì)照組和CIA組小鼠滑膜中IL-10與TGF-β的表達(dá)情況 (×200)Fig.3 IL-10 and TGF-β expression in synovial tissue of control and CIA mice(×200)

圖4 滑膜組織中IL-10和TGF-β mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.4 Relative mRNA levels of IL-10 and TGF-β in synovial tissuesNote: *.P<0.05.

表2 對(duì)照組與CIA組IL-10,TGF-β表達(dá)

Tab.2 IL-10 and TGF-β expression levels

GroupsIL-10(pg/ml)TGF-β(pg/ml)Control group58.45±7.3423.59±6.35CIA group90.01±9.011) 64.95±11.311)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖5 對(duì)照組與CIA造模組流式結(jié)果圖Fig.5 Flow cytometry results of control and CIA group

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的、伴隨骨和軟骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞、最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和畸形的慢性炎癥疾病，在人群中發(fā)病率為0.5%～1% 。迄今發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境和患者狀態(tài)等因素相關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚。RA的重要特征是機(jī)體免疫功能紊亂，其具體涉及T、B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的變化，并且已證實(shí)Breg在膠原誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型(Collagen-induced arthritis,CIA)以及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)揮了免疫抑制作用[12]。Breg發(fā)揮免疫抑制作用最重要的機(jī)制之一就是通過(guò)分泌IL-10來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。作為機(jī)體重要的抗炎因子，IL-10的靶細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞(APC，antigen presenting cell)和T淋巴細(xì)胞。IL-10可抑制TNF-β等炎癥因子的釋放，減少APC細(xì)胞中共刺激與黏附相關(guān)分子的表達(dá)；其次，IL-10還可以影響CD4+T細(xì)胞的分化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[13]。此外，一些調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(IL-21、TGF-β和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3等)和一些小分子蛋白酶類(lèi)物質(zhì)也共同參與RA的發(fā)生和發(fā)展。最后，在臨床檢測(cè)中B細(xì)胞占外周血中比例相對(duì)較少，B細(xì)胞亞群中的Breg細(xì)胞就更少了，給具體的臨床檢測(cè)和機(jī)制研究帶來(lái)了一些困難。

為解決上述問(wèn)題，本研究中首先建立了CIA小鼠模型，以研究RA的發(fā)生發(fā)展，并為將來(lái)的藥物篩選和治療奠定基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)CIA組小鼠足跖部出現(xiàn)腫脹，關(guān)節(jié)明顯紅腫增粗。CIA組與對(duì)照組關(guān)節(jié)炎評(píng)分差異顯著(P<0.05)。為探究Breg細(xì)胞在RA中的機(jī)制，以CD1dhighCD5+CD19high標(biāo)記Breg細(xì)胞，通過(guò)與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)CIA組小鼠脾臟中Breg細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)，證明小鼠脾臟中Breg細(xì)胞發(fā)生增殖和活化，并直接參與了RA過(guò)程。同時(shí)，CIA組滑膜細(xì)胞水腫，排列不整齊，有 3～5 層明顯增生，有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且CIA組滑膜細(xì)胞中IL-10和TGF-β的mRNA表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。此外，CIA組血清中IL-10和TGF-β的含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果RA中伴隨著表明小鼠血清和滑膜組織中IL-10和TGF-β表達(dá)水平同脾臟中Breg細(xì)胞比例成正相關(guān)，推測(cè)Breg細(xì)胞可引起小鼠血清話(huà)滑膜組織中的IL-10和TGF-β的升高。Breg細(xì)胞表達(dá)IL-1R和IL-6R，可以被炎癥反應(yīng)中的促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6激活并在炎癥部位富集[14]。在關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，髓源性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β和IL-6可以促進(jìn)Breg細(xì)胞的分化以及在關(guān)節(jié)滑膜的富集。然而，炎癥部位Breg細(xì)胞并不發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，Breg細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜處的富集也不是引發(fā)關(guān)節(jié)炎的因素。相反，在關(guān)節(jié)滑膜富集的Breg細(xì)胞可以進(jìn)一步響應(yīng)炎癥部位的炎癥因子如IL-21,GM-CSF等的刺激[15，16]，通過(guò)產(chǎn)生IL-10、TGF-β等炎癥抑制因子，負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)，并抑制關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展。因此，Breg細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑膜處富集并分泌炎癥抑制因子是機(jī)體自身免疫平衡調(diào)控的結(jié)果。

綜上所述，IL-10、TGF-β作為RA疾病過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，可一定程度上作為評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)度及判斷療效的重要指標(biāo)。而炎癥部位的IL-10和TGF-β可能來(lái)自于Breg細(xì)胞。Breg細(xì)胞相應(yīng)促炎因子的刺激在關(guān)節(jié)滑膜處富集，并通過(guò)分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫耐受，抑制過(guò)度免疫反應(yīng)。本研究揭示了Breg細(xì)胞在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病進(jìn)程中的重要作用，能夠?yàn)轭?lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療提供新思路，也相信通過(guò)動(dòng)物模型的深入研究將會(huì)為RA的臨床診斷和治療提供更多依據(jù)。