香遠(yuǎn)合劑對橋本氏甲狀腺炎大鼠Th1/Th2細(xì)胞平衡的影響及意義①

肖新懷

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,廣州510250)

橋本氏甲狀腺炎是一種比較常見的內(nèi)分泌疾病以及器官特異性自身免疫性疾病，也稱為自身免疫性甲狀腺炎[1]，在橋本氏甲狀腺炎的發(fā)病過程中Th1/Th2細(xì)胞的免疫失衡發(fā)揮重要作用，是Th1占優(yōu)勢的疾病[2]；西醫(yī)治療橋本氏甲狀腺炎具有一定效果，但西醫(yī)治療副作用大、容易復(fù)發(fā)，是臨床治療需要解決的難題之一；中醫(yī)治療橋本氏甲狀腺炎療效穩(wěn)定，且無明顯毒副作用，在臨床橋本氏甲狀腺炎治療中得到醫(yī)生的認(rèn)可[3]，香遠(yuǎn)合劑具有軟堅(jiān)散結(jié)、益氣扶正、養(yǎng)心安神的功效[4]，雷公藤在治療自身免疫性疾病上具有較好療效，本文建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫甲狀腺炎大鼠模型，以雷公藤作為陽性對照，觀察香遠(yuǎn)合劑對其Th1/Th2細(xì)胞平衡的影響，探討香遠(yuǎn)合劑對橋本氏甲狀腺炎的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動物：7周齡、雌性、清潔級、體重(140～150)g、大鼠64只，購自北京生命科學(xué)研究所，動物許可證號SYXK(京)2015-0002。主要試劑：雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司)，香遠(yuǎn)合劑(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院藥房)，甲狀腺球蛋白、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，TG-Ab、TPO-Ab、TSH、IFN-γ、IL-10 ELISA試劑盒(天津索羅門生物實(shí)驗(yàn)有限公司)，伊紅、蘇木素(中國病理試劑成套中心)，IFN-γ、IL-10、β-actin引物(上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成)，Trizol(美國MBI公司)，β-actin抗體、IFN-γ單克隆抗體、IL-10單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體、兔抗人IFN-γ多克隆抗體、兔抗人IL-10多克隆抗體、免疫組化試劑盒、BCA試劑盒(美國Tocris公司)等。

1.2方法

1.2.1動物分組及建立橋本氏甲狀腺炎模型 將64只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、模型組、雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組，每組16只。模型組、雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組建立動物模型，初次免疫時將甲狀腺球蛋白溶解到生理鹽水中制成濃度為2 mg/ml 的甲狀腺球蛋白溶液，等體積和完全弗氏佐劑混合乳化成油包水制劑，第0天，在大鼠尾根和足墊皮下注射甲狀腺球蛋白(100 μg)，對照組大鼠同樣部位注射等量生理鹽水；加強(qiáng)免疫時在第2周，將濃度為2 mg/ml的甲狀腺球蛋白溶液和不完全弗氏佐劑混合制成乳化劑，每只大鼠尾根和足墊皮下注射甲狀腺球蛋白(100 μg)，每周1次至第7周，期間給予高碘水(0.64 g/L碘化鈉)喂養(yǎng)，對照組大鼠相同部位注射等量生理鹽水，給予普通飼料和自來水喂養(yǎng)。

1.2.2各組大鼠處理 實(shí)驗(yàn)第6周開始，雷公藤多苷片組給予雷公藤多苷片(將雷公藤多苷片研磨成粉狀并用溫開水制成懸濁液)灌胃(劑量等同人每日用藥量×0.018×5)，1次/d至第10周；香遠(yuǎn)合劑組大鼠給予香遠(yuǎn)合劑(4 ml)灌胃，1次/d至第10周；模型組繼續(xù)每周皮下注射造模至第10周。

1.2.3動物取材 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，經(jīng)眼球取血離心后用于血清學(xué)檢查；取大鼠甲狀腺組織固定于福爾馬林中進(jìn)行病理分析。

1.2.4各組大鼠血清抗甲狀腺抗體、甲狀腺功能及血清IFN-γ、IL-10水平測定 采用ELISA法測定各組大鼠血清TG-Ab、TPO-Ab、TSH、IFN-γ、IL-10水平(實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行)。

1.2.5各組大鼠甲狀腺組織HE染色 將各大鼠甲狀腺標(biāo)本常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后切成厚 4 μm切片，常規(guī)進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.6各組大鼠甲狀腺組織免疫熒光染色 將甲狀腺切片于多聚甲醛固定液中固定4 h，PBS漂洗3次，加入小鼠抗CD45R(1∶500)，于4℃孵育過夜。二抗采用Aleax 555標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500),孵育30 min。于激光共聚焦顯微鏡拍照成像。

1.2.7各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10 mRNA水平測定 將各大鼠甲狀腺組織勻漿后，12 000 g離心15 min，取上清液提取甲狀腺組織總RNA，采用RT-PCR法測定大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10 mRNA水平，β-actin為內(nèi)參對照，反應(yīng)條件為94℃ 3 min；94℃ 45 min、46℃ 45 min、72℃ 45 min，共32個循環(huán)；72℃ 5 min。采用四星凝膠圖像分析系統(tǒng)對IFN-γ、IL-10、β-actin產(chǎn)物條帶密度進(jìn)行半定量分析。

1.2.8各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10蛋白水平測定 提取各組大鼠甲狀腺組織總蛋白質(zhì)，采用BCA法測定甲狀腺組織總蛋白質(zhì)濃度，采用Western blot測定甲狀腺組織IFN-γ、IL-10蛋白水平。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.9各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10免疫組化染色 采用免疫組化SP法染色測定，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。陽性細(xì)胞為細(xì)胞中出現(xiàn)黃褐色或棕黃色顆粒，采用捷達(dá)801形態(tài)分析軟件對結(jié)果進(jìn)行平均光密度、灰度值、陽性面積進(jìn)行測定，并計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠抗甲狀腺抗體、TSH和細(xì)胞因子水平比較 各組大鼠TG-Ab、TPO-Ab、TSH、IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組TG-Ab、TPO-Ab、IFN-γ、IFN-γ/IL-10升高(P<0.05)，TSH、IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組TG-Ab、TPO-Ab、IFN-γ、IFN-γ/IL-10降低(P<0.05)，TSH水平、IL-10升高(P<0.05)；與雷公藤多苷片組比較，香遠(yuǎn)合劑組TG-Ab、TPO-Ab、IFN-γ、IFN-γ/IL-10降低(P<0.05)，TSH、IL-10水平升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠甲狀腺組織HE染色比較 對照組大鼠甲狀腺濾泡呈橢圓形或圓形，未見漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡排列紊亂，被大量破壞，濾泡周圍有淋巴細(xì)胞浸潤，濾泡內(nèi)有漿細(xì)胞浸潤；雷公藤多苷片組濾泡破壞減少，濾泡內(nèi)及濾泡周圍漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤減少；香遠(yuǎn)合劑組大鼠甲狀腺濾泡較雷公藤多苷片組減少，漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤較雷公藤多苷片組減少。見圖1。

本研究顯示建模大鼠甲狀腺自身抗體水平升高，甲狀腺組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤和濾泡結(jié)構(gòu)破壞，表明建模成功。

2.3各組大鼠甲狀腺組織CD45R免疫熒光染色結(jié)果 為了進(jìn)一步證實(shí)甲狀腺組織存在淋巴細(xì)胞浸潤，利用抗大鼠CD45R抗體行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠CD45R表達(dá)顯著增加。與模型組相比，雷公藤多苷片組和香遠(yuǎn)合劑組大鼠CD45R表達(dá)明顯減少。見圖2。

2.4各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10 mRNA比較 各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10 mRNA比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，IL-10 mRNA升高(P<0.05)；與雷公藤多苷片組比較，香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。見表2。

2.5各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，IL-10蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，IL-10 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與雷公藤多苷片組比較，香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10 蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，IL-10蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見表3和圖3。

圖1 各組大鼠甲狀腺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of thyroid tissue in each group of rats (×200)Note: A.Control group；B.Model group；C.Tripterygium glycoside tablet group；D.Xiangyuan mixture group.

表1 各組大鼠抗甲狀腺抗體、TSH和細(xì)胞因子水平比較

Tab.1 Comparison of antithyroid antibody,TSH and cytokine levels in each group

GroupsnTG-Ab(μg/L)TPO-Ab(mU/L)TSH(mU/L)IFN-γ(pg/ml)IL-10(ng/L)IFN-γ/IL-10Control1638.16±4.4328.38±2.468.94±2.1394.35±7.06105.67±8.480.91±0.05Model1662.05±5.371)43.21±2.671)5.21±1.621)144.37±8.6876.54±7.261.90±0.09Tripterygium glycoside tablet1655.45±4.391)2)38.23±2.541)2)7.75±1.831)2)127.18±6.3484.27±7.511.51±0.07Xiangyuan mixture1644.06±4.541)2)3)34.72±2.491)2)3)6.42±1.741)2)3)114.62±6.1692.43±8.021.26±0.08

Note:Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with tripterygium glycosides group,3)P<0.05.

表2 各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10 mRNA比較

Tab.2 Comparison of IFN-γ,IL-10 and IFN-γ/IL-10 mRNA in thyroid tissue of rats in each group

GroupsnIFN-γIL-10IFN-γ/IL-10Control160.32±0.070.63±0.110.51±0.06Model160.81±0.121)0.27±0.081)3.01±0.091)Tripterygium glycoside tablet160.64±0.091)2)0.39±0.071)2)1.64±0.101)2)Xiangyuan mixture160.49±0.081)2)3)0.52±0.101)2)3)0.94±0.081)2)3)

Note:Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05；compared with tripterygium glycosides group,3)P<0.05.

表3 各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10蛋白比較(Western blot)

Tab.3 Comparison of IFN-γ,IL-10 and IFN-γ/IL-10 protein in thyroid tissue of each group of rats (Western blot)

GroupsnIFN-γIL-10IFN-γ/IL-10Control160.18±0.050.71±0.130.25±0.03Model160.67±0.091)0.38±0.071)1.76±0.071)Tripterygium glycoside tablet160.52±0.061)2)0.49±0.081)2)1.06±0.061)2)Xiangyuan mixture160.31±0.051)2)3)0.54±0.111)2)3)0.57±0.051)2)3)

Note:Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with tripterygium glycosides group,3)P<0.05.

圖2 各組大鼠甲狀腺組織CD45R染色結(jié)果(×200)Fig.2 Immunofluorescent staining of thyroid tissue in each group of rats (×200)Note: A.Control group；B.Model group;C.Tripterygium glycoside tablet group；D.Xiangyuan mixture group.

圖3 3各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ蛋白、IL-10蛋白Western blot電泳圖Fig.3 3 Western blot analysis of IFN-γ protein and IL-10 protein in thyroid tissue of rats in each groupNote: A.Control group;B.Model group;C.Tripterygium glycoside tablet group;D.Xiangyuan mixture group.

2.6各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10蛋白免疫組化染色 免疫組化結(jié)果顯示，IFN-γ、IL-10蛋白陽性為細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)黃褐色或棕黃色顆粒，模型組大鼠IFN-γ 染色最深，其次為雷公藤多苷片組，再次為香遠(yuǎn)合劑組，對照組IFN-γ染色最弱；模型組大鼠IL-10染色最弱，其次為雷公藤多苷片組，再次為香遠(yuǎn)合劑組，對照組IL-10染色最深，見圖4、圖5。各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10蛋白相對表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)，IL-10蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)，IL-10蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與雷公藤多苷片組比較，香遠(yuǎn)合劑組IFN-γ、IFN-γ/IL-10 蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)，IL-10 蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠甲狀腺組織IFN-γ、IL-10、IFN-γ/IL-10蛋白相對表達(dá)量比較(免疫組化染色)

Tab.4 Comparison of IFN-γ,IL-10 and IFN-γ/IL-10 protein relative expressin in thyroid tissue of each group of rats (immunohistochemical staining)

GroupsnIFN-γIL-10IFN-γ/IL-10Control group167.21±0.8514.63±1.740.49±0.21Model group1618.96±2.311)3.21±0.671)5.91±1.381)Tripterygium glycoside tablet group1614.35±1.421)2)6.78±1.121)2)2.12±0.821)2)Xiangyuan mixture group1611.73±1.161)2)3)10.96±1.311)2)3)1.07±0.471)2)3)

Note:Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with tripterygium glycosides group,3)P<0.05.

圖4 各組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ 免疫組化染色Fig.4 IFN-γ immunohistochemical staining in thyroid tissue of each group of ratsNote: A.Control group；B.Model group；C.Tripterygium glycoside tablet group；D.Xiangyuan mixture group.

圖5 各組大鼠甲狀腺組織中IL-10免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of IL-10 in thyroid tissue of each group of ratsNote: A.Control group；B.Model group;C.Tripterygium glycoside tablet group;D.Xiangyuan mixture group.

3 討論

橋本氏甲狀腺炎和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎具有相同的病理學(xué)基礎(chǔ)和臨床表現(xiàn)，典型的病理特征包括甲狀腺內(nèi)有彌漫的漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤以及產(chǎn)生特異性的TG-Ab、TPO-Ab抗體，最終引起甲狀腺濾泡的破壞。本研究通過建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)建模大鼠甲狀腺濾泡被破壞，出現(xiàn)大量漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，血清TG-Ab、TPO-Ab抗體水平顯著升高，表明自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型建立成功。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為橋本氏甲狀腺炎歸屬“癭病”范疇，發(fā)病機(jī)制和飲食水土、情志失調(diào)、體質(zhì)因素等有關(guān)，橋本氏甲狀腺炎的氣虛血瘀、氣滯痰凝、肝郁化火等病理機(jī)制導(dǎo)致血瘀、痰凝、氣滯壅結(jié)于頸前引起該病的發(fā)病[5]，根據(jù)中醫(yī)理論將中藥結(jié)合當(dāng)?shù)孛褡逅幬锝M方研制成香遠(yuǎn)合劑，香遠(yuǎn)合劑包括172味中藥，具有軟件散結(jié)、益氣扶正、養(yǎng)心安神的功效[6]，在臨床橋本氏甲狀腺炎的治療中具有較好效果[7]。雷公藤多苷片具有較好的抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫的作用，在治療自身免疫性疾病中療效顯著[8]。本文通過建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型，給予香遠(yuǎn)合劑治療，并以雷公藤多苷片為陽性對照，發(fā)現(xiàn)香遠(yuǎn)合劑和雷公藤多苷片治療橋本氏甲狀腺炎療效均顯著，可使甲狀腺濾泡組織基本恢復(fù)正常，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤程度明顯降低，血清TG-Ab、TPO-Ab抗體水平降低，甲狀腺功能異常有所恢復(fù)，但與雷公藤多苷片比較，香遠(yuǎn)合劑的治療效果更加顯著。本研究證實(shí)了香遠(yuǎn)合劑對橋本氏甲狀腺炎的治療效果顯著。

香遠(yuǎn)合劑通過何種機(jī)制治療橋本氏甲狀腺炎尚不十分清楚，尚待進(jìn)一步研究。橋本氏甲狀腺炎是由于抑制性T細(xì)胞存在遺傳性缺陷、輔助性T細(xì)胞和抗原結(jié)合抵抗甲狀腺上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)、抗體依賴的細(xì)胞毒作用的免疫機(jī)制，在橋本氏甲狀腺炎發(fā)病過程中Th1細(xì)胞因子亢進(jìn)、占據(jù)優(yōu)勢，Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)具有重要作用[9，10]。T淋巴細(xì)胞分為CD4和CD8 T淋巴細(xì)胞兩大亞群，正常情況下，CD4 T淋巴細(xì)胞處于前體狀態(tài)，表達(dá)少量的IL-2，當(dāng)特異性抗原刺激抗原遞呈細(xì)胞后誘導(dǎo)其成為前體細(xì)胞，在細(xì)胞因子的作用下分化為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-10等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫，Th1/Th2細(xì)胞平衡反映機(jī)體免疫傾向，兩者在正常情況下相互調(diào)節(jié)、相互抑制，處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持正常的細(xì)胞和體液免疫，當(dāng)兩者之間的平衡被打破時可引起橋本氏甲狀腺炎的發(fā)生[11]。IFN-γ為Th1細(xì)胞因子，可增強(qiáng)甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)HLA-Ⅱ類抗原的表達(dá)，該抗原表達(dá)可使甲狀腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗原遞呈細(xì)胞，激活CD4 T淋巴細(xì)胞IL-2受體，并引起IL-2細(xì)胞因子分泌釋放，IL-2細(xì)胞因子激活分泌其他細(xì)胞因子，趨化大量T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入甲狀腺內(nèi)增加細(xì)胞毒性作用，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞分化成熟并促進(jìn)自身抗體產(chǎn)生[12-14]。IL-10為一種Th2型細(xì)胞因子，在細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)因子作用，IL-10在甲狀腺組織浸潤的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)量隨著免疫疾病的進(jìn)展而減少，免疫疾病越嚴(yán)重，IL-10表達(dá)量越低，在終末期橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中幾乎沒有IL-10細(xì)胞因子的表達(dá)[15-17]。本研究中自身免疫性甲狀腺炎的模型大鼠的血清和腦組織IFN-γ、IFN-γ/IL-10升高，IL-10水平下降，表明自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型存在Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)；香遠(yuǎn)合劑治療后大鼠血清和腦組織IFN-γ、IFN-γ/IL-10下降，IL-10水平升高。分析香遠(yuǎn)合劑治療橋本氏甲狀腺炎機(jī)制可能為通過糾正Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)在橋本氏甲狀腺炎的治療中發(fā)揮作用。