尋常型銀屑病中DUSP1和DUSP4的表達(dá)

孫獻(xiàn)琪 栗玉珍

銀屑病是一種常見(jiàn)的免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，具有冬重夏輕的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。而銀屑病的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，目前認(rèn)為與遺傳因素、環(huán)境因素及免疫因素等相關(guān)[2]。雖然銀屑病發(fā)生發(fā)展的早期階段仍不清楚，但普遍認(rèn)為MAPK信號(hào)通路異常與銀屑病的發(fā)病關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損區(qū) MAPK信號(hào)的磷酸化細(xì)胞外信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellularsignal-regulated kinace, P-ERK)的活性明顯高于非皮損區(qū)，治療前銀屑病皮損ERK活性明顯高于治療后。而MAPK信號(hào)的輸出取決于MAPK磷酸化的程度和持續(xù)時(shí)間，這表明信號(hào)失活機(jī)制與級(jí)聯(lián)信號(hào)本身的活化一樣重要。雙特異性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DUSP)是一類廣泛參與機(jī)體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育的具有酪氨酸特異性的磷酸酶。它可以介導(dǎo)磷酸絲氨酸/磷酸蘇氨酸和磷酸殘留的MAPK的去磷酸化，是一種MAPK的負(fù)調(diào)節(jié)劑。目前已知DUSPs在調(diào)節(jié)血管生成因子下游MAPK信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，而MAPK信號(hào)通路異常與銀屑病的發(fā)病關(guān)系密切，但DUSPs與銀屑病的相關(guān)性在國(guó)內(nèi)外學(xué)者中卻無(wú)人探究。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Real-timePCR和Western blot方法檢測(cè)尋常型銀屑病和正常對(duì)照組的組織中DUSP1和DUSP4的表達(dá)情況，從而探討DUSP1和DUSP4與尋常型銀屑病發(fā)病的關(guān)系，為闡明銀屑病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供重要的理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫

理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并經(jīng)過(guò)患者的知情同意取18例就診于本院皮膚科門診和病房患者的新鮮皮損，取材部位是軀干和四肢。臨床表現(xiàn)均是典型的局限或廣泛分布的鱗屑性的紅斑或者斑塊，通過(guò)兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行組織病理學(xué)確定診斷，取材前三個(gè)月未系統(tǒng)外用治療銀屑病的藥物如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等。15名正常對(duì)照組皮膚組織來(lái)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形美容科的面部美容手術(shù)患者，均無(wú)皮膚疾病。

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑 兔抗人多克隆抗體DUSP1購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。全蛋白抽提試劑盒、Western Blotting和Real-timePCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。DUSP1上游引物5’- GAGCTGTGCAGCAAACAGTC-3’，下游引物5’- GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT -3’，DUSP4上游引物5’- TCACGGCTCTGTTGAATGTC -3’，DUSP4下游引物5’- GATGTCGGCCTTGTGGTTAT -3’，β-actin上游引物5’-CCCTGGCACCCAGCAC-3’，下游引物5’-GCCGATCCACACGGAGTAC-3’引物序列均由上海英俊生物工程有限公司提供。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)尋常型銀屑病DUSP1和DUSP4的表達(dá) 從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存管中的試驗(yàn)組和對(duì)照組的皮膚組織，進(jìn)行新鮮組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系為總反應(yīng)物20 μL，包括總RNA 1 μL，引物為 2 μL，dNTPs(10 mM)1 μL，5*TS RT Buffer 5 μL，TransScript RT 1 μL，Rnase-free Water 10 μL見(jiàn)表1。采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。Real-time PCR反應(yīng)條件為：94℃變性5 min,94℃ 變性 10 s,57℃ 退火30 s,65℃ 5 s(45個(gè)循環(huán)),72℃終延伸5 min。

表1 Real-time PCR 反應(yīng)體系

1.4 Western blot檢測(cè)尋常型銀屑病DUSP1和DUSP4的表達(dá) 組織收集后，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中并加入配制好的冷Lysis Buffer并置于玻璃勻漿器中，手動(dòng)勻漿，低溫操作；14,000 r/min，4℃離心15 min，分離上清即為全蛋白提取物，蛋白定量；分裝保存于-70℃，避免反復(fù)凍融。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模、印記等操作步驟。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所用的數(shù)據(jù)都是以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表達(dá)。兩組之間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尋常型銀屑病患者與對(duì)照組中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表達(dá)水平檢測(cè) 為探尋尋常型銀屑病患者皮膚組織中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表達(dá)情況，我們用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)尋常型銀屑病患者皮膚組織和正常對(duì)照組組織中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表達(dá)水平。銀屑病組DUSP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.0939±0.0048, 正常對(duì)照組為0.2486±0.0060,P<0.05。銀屑病組DUSP4mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.3718±0.0370,正常對(duì)照組為0.3645±0.0286,P>0.05(圖1)。結(jié)果顯示與正常皮膚組織相比，DUSP1mRNA在尋常型銀屑病中表達(dá)水平明顯降低而DUSP4mRNA在銀屑病中表達(dá)水平?jīng)]有變化(圖1)。

*P<0.05

2.2 Western blot檢測(cè)DUSP1蛋白和DUSP4蛋白的表達(dá) 為了檢測(cè)在尋常型銀屑病皮膚組織中DUSP1蛋白和DUSP4蛋白的表達(dá)量，我們用Western blot提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。銀屑病組DUSP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.5165±0.0254, 正常對(duì)照組為1.2432±0.3260,P<0.05。銀屑病組DUSP4蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.8018±0.0770,正常對(duì)照組為1.3677±0.2287,P>0.05(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比尋常型銀屑病患者皮膚組織中的DUSP1蛋白表達(dá)水平下調(diào)而DUSP4組沒(méi)有明顯變化(圖2)。

3 討論

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，全世界上約1%～3%的人群飽受其困擾[3,4]。銀屑病不僅是一種皮膚病，而且是一種系統(tǒng)性疾病[5,6]。到目前為止，人類對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)都處于初級(jí)階段。目前對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究普遍認(rèn)為MAPK信號(hào)通路的異常與銀屑病的發(fā)病關(guān)系密切。DUSPs可以介導(dǎo)MAPK的去磷酸化，是MAPK的負(fù)調(diào)節(jié)劑。而在調(diào)節(jié)血管生成因子下游MAPK信號(hào)通路中,DUSPs發(fā)揮著重要作用,并且DUSPs在炎癥性疾病中的作用也被研究證明。但DUSPs在尋常型銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用和意義在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中卻未見(jiàn)報(bào)道。

*P<0.05

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)檢測(cè)和比較尋常型銀屑病的皮損組織與正常人對(duì)照組皮膚組織中DUSP1和DUSP4的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)DUSP1在尋常型銀屑病皮損組織中表達(dá)水平相對(duì)較低，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。發(fā)現(xiàn)DUSP4在尋常型銀屑病皮損組織中表達(dá)水平和正常人對(duì)照組的組織中表達(dá)水平不存在明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究的結(jié)果提示DUSP1與尋常型銀屑病具有一定的相關(guān)性。

DUSP1基因位于人類染色體5q34,定位于細(xì)胞核中，它在炎癥反應(yīng)、血管生成、癌癥、代謝、糖尿病等多種生理過(guò)程和疾病中發(fā)揮重要的生理作用[7]。DUSP1的去磷酸化作用主要依賴于MAPK信號(hào)通路。近些年來(lái)，研究證實(shí)DUSP1是炎癥反應(yīng)重要的負(fù)調(diào)控因素之一。DUSP1在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，Shen等[8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用脂多糖刺激DUSP1基因敲出小鼠的巨噬細(xì)胞時(shí)，MAPK信號(hào)通路激活的強(qiáng)度與激活的時(shí)間均大于正常對(duì)照組，并同時(shí)出現(xiàn)白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎性因子的過(guò)度分泌。由此可見(jiàn)，DUSP1是炎癥反應(yīng)的重要的負(fù)調(diào)控因素之一。Czikk和Shen等[9,10]研究證明上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DUSP1的表達(dá)，抑制了p38MAPK信號(hào)通路的活性從而抑制TNF-α介導(dǎo)了血管內(nèi)皮通透性增加，進(jìn)而可以抑制粥樣斑塊的形成?？梢?jiàn)，DUSP1參與調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥的強(qiáng)度，有可能成為治療炎癥相關(guān)疾病的新方向。

本實(shí)驗(yàn)有一定局限性和不足之處。實(shí)驗(yàn)選擇的樣本的數(shù)量相對(duì)較少且均為中國(guó)東北地區(qū)的銀屑病患者。由于本研究的方法的局限性，尚未發(fā)現(xiàn)DUSP1對(duì)銀屑病具體的作用機(jī)制。在今后的研究中，本課題組還要繼續(xù)上述作用機(jī)制的研究，使本課題的理論依據(jù)更加完善。探討DUSPs與尋常型銀屑病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，為闡明尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供一定的理論支持。