富含亞油酸-神經(jīng)酰胺的保濕劑在特應(yīng)性皮炎鼠模型中的作用研究

王孝盼 權(quán) 晟 陳利紅 鄭 捷

皮膚屏障破壞和繼發(fā)炎癥反應(yīng)是特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)發(fā)生的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。部分特應(yīng)性皮炎患者的絲聚蛋白(Filaggrin，F(xiàn)LG)基因缺陷或脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因異常導致皮膚屏障破壞[2,3]，存在于表皮外的物質(zhì)如各種微生物作為變應(yīng)原更易與皮膚中豐富的免疫活性細胞接觸，誘導Th2型為主的炎癥反應(yīng)[4,5]。Th2細胞通過分泌細胞因子如IL-4和IL-13，抑制皮膚屏障功能結(jié)構(gòu)蛋白的基因表達，例如絲聚蛋白、兜甲蛋白等；抑制表皮脂質(zhì)分泌；下調(diào)抗菌肽LL-37，hBD2等進一步損害屏障[6-8]。因此，皮損部位皮膚屏障的破壞和皮膚免疫炎癥反應(yīng)相互作用形成惡性循壞，AD的特征性臨床癥狀得以持續(xù)存在甚至加重。

保濕劑已廣泛用于AD的基礎(chǔ)治療，應(yīng)用保濕劑可以顯著減輕皮損程度甚至在痊愈后持續(xù)使用可以降低疾病復發(fā)率[9,10]。保濕劑通過增加皮膚角質(zhì)層的水合達到修復皮膚屏障的作用，因此，又被稱為“皮膚屏障修護劑”。補充含有適當比例脂肪酸、神經(jīng)酰胺、膽固醇的保濕劑具有促進皮膚通透屏障修復的作用[11]。保濕劑是AD的基礎(chǔ)治療，其機制主要是對AD受損的屏障進行修復，而外用保濕劑調(diào)節(jié)皮膚炎癥作用機制尚未完全闡明。

我們推測富含LA-Cer的保濕劑兼具修復皮膚屏障和抗炎作用，從而抑制炎癥和皮膚屏障破壞間的惡性循環(huán)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 卡泊三醇(calcipotriol/MC903)購自英國Tocris公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；Eastep? Super Total RNA Extraction Kit購自上海Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；SYBR Green PCR Master Mix購自美國Roche公司。Coneometer CM825購自德國CK公司，富含亞油酸-神經(jīng)酰胺的保濕劑玉澤皮膚屏障修護精華乳由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科與上海家化聯(lián)合股份有限公司聯(lián)合研制。

1.2 實驗動物 均購自Jackson Laboratory公司，6～8周齡雌性BALB/c小鼠。

1.3 分組 實驗動物18只，隨機分為疾病組，治療組，對照組(EtOH)。疾病組鼠耳每天一次均勻涂抹2 nmol卡泊三醇溶液14天；治療組以卡泊三醇誘導AD模型同時，每天予兩次涂抹富含LA-Cer的保濕劑于鼠耳；對照組鼠耳每天一次涂抹20 μL無水乙醇14天。

1.4 RT-PCR 采用Trizol和promega總RNA抽提試劑盒提取鼠耳皮膚組織總RNA，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)獲得cDNA后，采用SYBR為熒光標記物的RT-PCR檢測皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-10等的表達。結(jié)果表示為相對管家基因互達量(2-△ct)，其中ct為循環(huán)值。引物序列參考β-actin-F:TGTCCACCTTCCAGCAGATGT,β-actin-R: AGCTCAGTAACAGT-CCGCCTAG; TSLP-F GCAAATCGAGGACTGTGAG-AGC, TSLP-R: TGAGGGCTTCTCTTGTTCTCCG; IL-4-F: ATCATCGGCATTTTGAACGAGGTC, IL-4-R: ACCTTGGAAGCCCTACAGACGA; IL-33-F: CTACTGCATGAGACTCCGTTCTG, IL-33-R: AGAATCCCGTGGATAGGCAGAG; IL-10-F: TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA, IL-10-R: TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA; IL-1β-F: TGGACCTTCCAGGATGAGGACA, IL-1β-R: GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG; IFNγ-F: CAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGG, IFNγ-R: TTTCCGCTTCCTGAGGCTGGAT; FLG-F: ACAGGTGGTCATGGCAGAAGCT, FLG-R: CTCCATCTCAGATACCAGGTCC.由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用Graph Prism version 7.0 統(tǒng)計分析，表示為均數(shù)±標準差，兩組間采用非成對t檢驗(Unpaired t test)比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 富含LA-Cer的保濕劑對卡泊三醇誘導AD表型的影響 卡泊三醇涂抹鼠耳后出現(xiàn)紅腫脫屑，造模成功。與疾病組比較，治療組紅腫脫屑明顯減輕(圖1a)。治療組病理HE染色切片顯示表皮厚度較疾病組明顯減輕，與對照組比較無差異(圖1b)。疾病組鼠耳厚度(0.510±0.035)cm較對照組(0.197±0.009)cm均增加，治療組(0.375±0.015)cm較疾病組明顯變薄(P<0.0001)，與對照組比較仍增厚(圖1c)。在第7天已經(jīng)出現(xiàn)三組鼠耳厚度差異，第14天三組鼠耳厚度差異更加明顯(圖1d)。

2.2 富含LA-Cer的保濕劑對卡泊三醇誘導的AD樣皮損相關(guān)炎癥因子的影響 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR)檢測對照組，疾病組，治療組鼠耳皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-10，IL-1β，IL-33，IFNγ的表達。與對照組比較，疾病組皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-10，IL-1β， IFNγ表達均增高(P<0.05)，IL-33有升高趨勢 。與疾病組比較，治療組皮膚組織中TSLP，IL-4，IL-1β表達降低，TSLP，IL-1β表達的下降有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而調(diào)節(jié)性的細胞因子IL-10的表達在疾病組和治療組未見明顯差異(圖2)。

2.3 富含LA-Cer的保濕劑對卡泊三醇誘導的AD皮膚屏障的影響 疾病組皮損內(nèi)FLG表達較對照組降低，治療組與疾病組比較FLG表達升高(P=0.1359)(圖3a)。疾病組鼠耳皮膚含水量(6.750±1.258)au明顯低于對照組(39.250±6.130)au(P<0.0001)。與疾病組比較，治療組皮膚含水量(22.500±2.081)au恢復(P<0.0001)(圖3b)。

1a：皮損嚴重程度；1b：鼠耳組織病理(HE,×100)；1c：鼠耳厚度變化；1d：第7、14天鼠耳厚度比較。數(shù)據(jù)顯示平均值±標準差(n=6)，***P<0.001 ****P<0.0001

圖1 保濕劑對AD樣皮損表型的影響

2a：TSLP表達；2b：IL-4表達，IFNr表達；2c：IL-1β表達，IL-33表達，IL-10表達。數(shù)據(jù)顯示平均值±標準差(n=6)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 保濕劑對AD樣皮損內(nèi)相關(guān)炎癥因子mRNA表達的影響

3a：FLG mRNA的表達；3b：皮膚含水量的變化。數(shù)據(jù)顯示平均值±標準差(n=6)，*P<0.05，****P<0.0001

圖3 保濕劑對AD屏障的影響

3 討論

保濕劑應(yīng)用于輕度AD可以顯著改善皮膚水含量，減輕疾病嚴重程度，并減少AD復發(fā)的頻率和強度[9，12，13]，保濕劑的作用主要在于修復皮膚屏障。但部分保濕劑可能會損害皮膚屏障，引起皮膚慢性炎癥反應(yīng)[14]。該研究發(fā)現(xiàn)富含LA-Cer的保濕劑對皮膚屏障修復和炎癥控制均有益。AD皮損長鏈神經(jīng)酰胺、脂肪酸的含量均降低[21]，出現(xiàn)屏障破壞。卡泊三醇涂抹鼠耳后皮膚屏障破壞，皮膚干燥。富含LA-Cer的保濕劑明顯增加皮膚水含量，另一方面通過補充皮損局部缺失的神經(jīng)酰胺、亞油酸維持角質(zhì)層脂質(zhì)平衡，補充不飽和脂肪酸可能通過刺激PPARr增加內(nèi)源性脂質(zhì)合成[22]，調(diào)動機體自身修復屏障。

皮損處Th1和Th2失衡，TSLP、IL-4/IL-13以及IFNγ等細胞因子表達增強是AD重要免疫學特征[15，16]。卡泊三醇作為維生素D的衍生物與受體結(jié)合后，刺激角質(zhì)形成細胞分泌TSLP，活化Th2細胞分泌IL-4/IL-13，誘導原始T細胞向Th2細胞分化[15，17]?？ú慈即龠M皮膚中TSLP，IL-4，IL-1β，IL-33，IL-10，IFNγ表達[18]。研究顯示外用富含LA-Cer的保濕劑降低卡泊三醇誘導的AD鼠模型皮膚TSLP、IL-4和IL-1β表達，外用富含LA-Cer的保濕劑具有抑制AD中Th2細胞因子的作用，還抑制炎癥共同通路的炎癥因子IL-1β。Th1型細胞因子IFNγ和調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10皮損局部表達未見明顯降低，卡泊三醇誘導的AD鼠模型中皮損主要由Th2類細胞因子高表達導致，猜想外用保濕劑后，皮損嚴重程度變化趨勢最相關(guān)的是Th2類細胞因子表達變化。

TSLP、IL-4和IFNγ有抑制角質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)蛋白表達，破壞皮膚屏障的作用。阻斷TSLP，IL-4信號通路，F(xiàn)LG的表達升高，皮膚屏障修復[19]。研究中觀察到外用富含LA-Cer的保濕劑抑制TSLP，IL-4表達，促進FLG的表達。猜測外用富含LA-Cer的保濕劑抑制特應(yīng)性皮炎樣炎癥，促進皮膚屏障的修復,阻斷“由外至內(nèi)，再到外”的循環(huán)，該循環(huán)解釋了AD屏障相關(guān)遺傳異常在外界因素刺激下易發(fā)生下游炎癥，產(chǎn)生的Th2類細胞因子反過來破壞滲透屏障功能，加重AD的機制[20]。所以，皮膚屏障的修復隔絕外源性刺激物或者過敏源來減輕皮膚炎癥反應(yīng)，兩者形成良性循環(huán)。

絲聚蛋白(flaggrin，F(xiàn)LG)基因突變是導致AD患者皮膚屏障破壞的重要因素，AD患者皮損與非皮損區(qū)FLG表達均較正常人低[6，23]?？ú慈寄芤种艶LG表達，該研究結(jié)果顯示外用富含LA-Cer的保濕劑可能具有促進FLG表達，促進角質(zhì)細胞分化，內(nèi)源性修復皮膚屏障的作用。

綜上，我們在AD鼠模型上研究富含LA-Cer的保濕劑對特應(yīng)性皮炎的影響，結(jié)果顯示外用富含LA-Cer的保濕劑阻斷炎癥和屏障破壞的惡性循環(huán)，具有抑制炎癥和修復屏障的雙重作用，從而改善特應(yīng)性皮炎的癥狀。具體通路機制仍待于進一步探究。