臺(tái)州地區(qū)漢族哮喘人群5-HTT 基因Stin2 位點(diǎn)多態(tài)性分析與抑郁易感性研究

林 玲 徐友文 徐佳佳 裴 璐 呂冬青

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是氣道慢性炎癥疾病，也是具有多基因遺傳傾向的疾病。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）作為一種廣泛存在的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與情緒神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)，與抑郁發(fā)生密切相關(guān)，亦是哮喘神經(jīng)因素發(fā)生機(jī)制的重要組成部分。5-HTT 的第二內(nèi)含子可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多態(tài)性即Stin2 位點(diǎn)的多態(tài)性已被證實(shí)是與抑郁發(fā)病相關(guān)的功能位點(diǎn)[1]。本研究探討5-HTT 基因多態(tài)性，檢測Stin2 多態(tài)位點(diǎn)，分析其與哮喘發(fā)生及哮喘患者合并抑郁的相關(guān)性，有助于深入了解該基因在哮喘發(fā)病機(jī)制中的意義。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象 選取2017 年7 月—2018 年7 月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院及門診治療的臺(tái)州地區(qū)漢族哮喘患者204 例，其中女99 例，男105 例，平均年齡43.2 歲，為哮喘組，漢族健康志愿者200 名，其中男100 名，女100 名，平均年齡41.4 歲，為對(duì)照組。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核通過。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，相互無血緣性關(guān)系。

1.2 入選、排除標(biāo)準(zhǔn) 哮喘組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）按中華醫(yī)學(xué)會(huì)2016 年支氣管哮喘防治指南[2]，確診為哮喘患者；（2）年齡＞18 歲；（3）既往1 年內(nèi)曾行支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽性或支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽性，入組時(shí)處于哮喘慢性持續(xù)期；（4）長期生活在浙江臺(tái)州，三代均為漢族，家族內(nèi)未與其他民族通婚。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）哮喘急性發(fā)作期；（2）難治性哮喘；（3）合并嚴(yán)重肝、腎、心臟等原發(fā)性疾病；（4）曾有精神性疾病。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞18 歲的健康人群；（2）長期生活在浙江臺(tái)州，三代均為漢族，家族內(nèi)未與其他民族通婚；（3）近1 個(gè)月內(nèi)無急性上呼吸道感染；（4）近1 年內(nèi)肺部X 線檢查未見異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）過敏性疾病史；（2）個(gè)人及家族哮喘病史；（3）合并精神性疾??；（4）合并嚴(yán)重肝、腎、心臟等原發(fā)性疾病；（5）全身免疫性疾??；（6）合并支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺病、肺癌等肺部疾病。

2 方 法

2.1 研究方法 簽署自愿簽署知情同意書后，以問卷調(diào)查形式，讓被研究者填寫抑郁自評(píng)量表（SDS）[3]，以評(píng)估被研究者生存質(zhì)量及抑郁情緒。根據(jù)調(diào)查結(jié)果將調(diào)查對(duì)象分為抑郁組和非抑郁組。（1）自設(shè)問卷調(diào)查：獲取調(diào)查對(duì)象臨床特征和基本人口學(xué)資料。（2）抑郁自評(píng)量表（SDS）：由20 個(gè)指標(biāo)構(gòu)成，SDS 標(biāo)準(zhǔn)分/80X100%為抑郁指數(shù)，70%以上為重度抑郁；60%～69%為中至重度抑郁；50%～59%為輕微至輕度抑郁；50%以下者為無抑郁。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 儀器及試劑 美國ABI 公司2720 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀；美國ABI 公司3730XL 型DNA 測序儀；人全血基因組DNA 提取試劑盒、基因分型試劑盒均購自Takara 公司。

2.2.2 基因組DNA 提取 抽取研究對(duì)象外周靜脈血2mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管，使用Takara 公司人全血基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，于-70℃冰箱保存待使用。

2.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 通過NCBI 查詢5-HTT 基因Stin2 位點(diǎn)的全長序列，使用網(wǎng)頁P(yáng)rimer 3.0 設(shè)計(jì)引物，Stin2 的上下游引物分別為5’-GTCAGTATCACAGGCTGCGAG-3’和5’-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3’。引物由蘇州貝斯派生物科技有限公司合成。

2.2.4 PCR 擴(kuò)增 采用qRT-PCR 方法對(duì)Stin2 基因多態(tài)性進(jìn)行檢測。Stin2 擴(kuò)增條件：95℃3min，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35 個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10min。取5-HTT 基因Stin2 擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠進(jìn)行100V 電泳30～40min，取出凝膠板放置于紫外燈下觀察，使用全自動(dòng)凝膠數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行目的基因片段分析擴(kuò)增。使用瓊脂糖凝膠電泳的形式對(duì)擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收的方式純化。對(duì)膠回收的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行定量（點(diǎn)膠或測260/280），按照測序SOP 所標(biāo)注的測序反應(yīng)的方案來安排測序PCR 反應(yīng)，然后對(duì)測序PCR 的樣品進(jìn)行磁珠純化。在DNA 測序儀上機(jī)測序。與目的序列進(jìn)行分析比對(duì)，對(duì)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性采用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。各等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。采用行—列表卡方檢驗(yàn)方法對(duì)基因型和等位基因頻率進(jìn)行兩兩差異比較。使用Upphase 軟件分析單倍型，其他資料采用SPSS 18.0 軟件分析。用卡方檢驗(yàn)分析5-HTT 基因Stin2 位點(diǎn)與哮喘及哮喘發(fā)生抑郁的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照組、哮喘組的Stin2 基因達(dá)到遺傳平衡，具有代表意義。Stin2出現(xiàn)3 種基因型Stin2.10/Stin2.10（267bp），Stin2.10/Stin2.12（267bp，301bp），Stin2.12/Stin2.12（301bp）。哮喘組Stin2.12/12 基因型頻率71.6%，對(duì)照組頻率82.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。哮喘組Stin2.10/12 基因型頻率25.5%，對(duì)照組頻率16.50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）。Stin2.12、Stin2.10 等位基因頻率在哮喘組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.650，P=0.006）。見表1-2、圖1。

表1 哮喘組與對(duì)照組Stin2 位點(diǎn)基因頻率比[例（%）]

表2 哮喘組與對(duì)照組Stin2 等位基因頻率比[例（%）]

3.2 哮喘患者與對(duì)照組合并抑郁情況 哮喘患者并發(fā)抑郁者88 例，發(fā)生率43.1%（88/204），其中重度抑郁16 例，占7.8%（16/204）；中度抑郁28 例，占13.7%（28/204）；輕度抑郁44 例，占21.5%（44/204）。對(duì)照組并發(fā)抑郁者34 例發(fā)生率17%（34/200），其中重度抑郁4 例，占2%（4/200）；中度抑郁12 例，占6%（12/200）；輕度抑郁18 例，占9%（18/200）。哮喘組抑郁發(fā)生率顯著高于對(duì)照組（χ2=32.73，P＜0.05），見表3。

圖1 Stin2 測序圖譜

表3 哮喘組與對(duì)照組發(fā)生抑郁情況的比較[例（%）]

3.3 哮喘組Stin2 不同基因型及等位基因頻率與抑郁發(fā)生情況的比較 哮喘組中發(fā)生抑郁的Stin2.12/12 基因型頻率為81.8%，非抑郁頻率為63.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。哮喘組中發(fā)生抑郁的Stin2.10/12 基因型頻率為14.7%，非抑郁頻率為33.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。哮喘組Stin2基因的12、10 等位基因在抑郁組和非抑郁組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4-5。

表4 哮喘組Stin2 不同基因型頻率與抑郁發(fā)生情況比較[例（%）]

表5 哮喘組Stin2 不同等位基因頻率與抑郁發(fā)生情況比較[例（%）]

4 討論

5-HT 是體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)成分，同時(shí)也是機(jī)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)劑，其廣泛存在于嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血小板等細(xì)胞中，在變態(tài)反應(yīng)炎癥過程中介導(dǎo)一系列的細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞吞噬、分泌細(xì)胞因子等[4]。5-HT 可通過抑制白介素-12活性并促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞分泌前列腺素-2 來調(diào)節(jié)肺內(nèi)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮作用，以化學(xué)引誘物形式促進(jìn)嗜酸細(xì)胞的遷移和交換來引起哮喘發(fā)作[5]。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者中有27%合并抑郁，高于正常人群[6]。5-HT 受5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（5-HTT）的調(diào)控，多項(xiàng)研究已發(fā)現(xiàn)5-HTT 基因Stin2 多態(tài)性可能與哮喘的發(fā)病相關(guān)。5-HTT 基因的功能多態(tài)性位點(diǎn)包含第二內(nèi)含子可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR Stin2）。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，5-HTT 基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，其中與抑郁、慢性阻塞性肺病、骨質(zhì)疏松癥、肥胖疾病相關(guān)性已有多項(xiàng)報(bào)道并且有區(qū)域及種族差異，表明5-HTT 基因的多態(tài)性位點(diǎn)可能具有復(fù)制的生物學(xué)作用，需進(jìn)一步的探索其具體生物學(xué)功能以促進(jìn)研究[7-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，5-HTT 基因多態(tài)性在健康組，哮喘組和無焦慮組，以及哮喘和焦慮組中的分布有顯著差異，同時(shí)5-HTT 的表達(dá)增加了哮喘患者發(fā)生焦慮的風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究結(jié)果顯示，臺(tái)州地區(qū)漢族哮喘患者中43.1%發(fā)生抑郁，遠(yuǎn)高于健康對(duì)照組的17%。Stin2.10/Stin2.12、Stin2.12/Stin2.12 基因型頻率在哮喘組和正常對(duì)照組中構(gòu)成比存在顯著性差異，Stin2.10 等位基因頻率在哮喘組中較對(duì)照組增高，提示該等位基因攜帶者可能為發(fā)生哮喘易感因素。王嵐等[12]研究發(fā)現(xiàn)Stin2 多態(tài)性的等位基因和基因型頻率在男性健康組和男性哮喘組之間存在差異，在男性哮喘組中Stin2.12/Stin2.10 基因型和Stin2.10 等位基因型所占比例高于健康對(duì)照組，含有Stin2.10等位基因型或Stin2.12/Stin2.10 基因型的男性發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)分別增高1.9 倍和2.3 倍。這提示存在5-HTT 基因Stin2.12/Stin2.10 基因型和Stin2.10 等位基因型人群發(fā)生哮喘風(fēng)險(xiǎn)增加，且可能與性別相關(guān)，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。國外研究發(fā)現(xiàn)，Stin2.12等位基因與煙草暴露合并和情緒障礙呈正相關(guān)，可引起情緒障礙，抑郁或雙相抑郁[1]。本研究顯示，哮喘合并抑郁組Stin2.10/Stin2.12、Stin2.12/Stin2.12 基因頻率和哮喘非抑郁組的表達(dá)具有顯著性差異。哮喘組Stin2 基因的12、10 等位基因表達(dá)在抑郁組和非抑郁組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Stin2 基因的12等位基因表達(dá)在抑郁組高于非抑郁組，提示哮喘Stin2.12 等位基因攜帶者為抑郁發(fā)生易感因素。

本研究結(jié)果顯示，5-HTT 基因中Stin2 基因多態(tài)性與臺(tái)州地區(qū)漢族人群發(fā)生哮喘呈顯著相關(guān)。在哮喘人群中Stin2.12 等位基因攜帶者為抑郁發(fā)生易感因素，可能與哮喘伴發(fā)抑郁易感性有關(guān)。但基于本研究樣本不夠全面，存在一定的區(qū)域局限性，有必要在今后的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。