分析Gal-3、BRAFV600E基因突變及hTERT檢測在PTC診療中的應用價值

余 暉，張京偉，汪紅英，胡月玲，晏 茜

甲狀腺癌發(fā)病因素目前尚未明確，但多與高碘飲食、放射性接觸史、遺傳等因素相關，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)為甲狀腺癌最常見的類型[1]。隨著蛋白組學及基因組學的發(fā)展，腫瘤標志物及基因突變對惡性腫瘤診療的影響受到廣泛關注[2]。半乳糖凝集素3(Gal-3)參與細胞與細胞、細胞與間質之間黏附和炎癥反應，并調控細胞生長、凋亡等多種生理病理過程，在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用[3]。端粒酶能使細胞獲得無限增殖的能力，具有促進甲狀腺癌等惡性腫瘤細胞增殖的作用，端粒酶反轉錄酶(hTERT)則為維持其活性最重要的成分[4]。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)基因突變?yōu)榻陙砑谞钕倌[瘤研究的重大突破，BRAF基因突變僅發(fā)生于PTC，在甲狀腺其他病變中未見突變，且BRAFV600E為最常見基因突變位類型，對PTC的診療有重要作用[5]?；诖?，本研究收集手術治療的PTC患者手術病理標本和臨床資料，以分析PTC癌組織Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變情況及對患者預后的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年3月～2015年10月在醫(yī)院行手術治療的86例PTC患者手術病理標本和臨床資料。納入標準：行擇期甲狀腺切除+頸清掃術治療者；經病理檢查確診為PTC；臨床資料齊全；術后隨訪時間≥3年者。排除標準：術前行放化療等抗腫瘤治療；合并其他惡性腫瘤者。86例中，女62例，男 24 例；年齡 32～60（46.22±9.10）歲；腫瘤最大直徑≤2 cm 54例，＞2 cm 32例；伴淋巴結轉移18例。

1.2 檢測指標 PTC癌組織及癌旁組織均經甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、沖洗、染色、脫水后封片，使用免疫組化法測量Gal-3、hTERT表達水平；采用聚合酶鏈式反應(PCR)法和脫氧核糖核酸(DNA)測序法測量BRAFV600E突變情況。Gal-3一抗為鼠抗人Gal-3單克隆抗體，試劑盒由美國Zymed Laboratories公司生產；hTERT一抗為兔抗人hTERT多克隆抗體，試劑盒由美國SANTA CRUZ公司生產；BRAFV600E突變檢測試劑盒由北京鑫諾美迪基因公司生產，采用DNA測序儀（美國Applied Biosystems公司，型號：D 3130）和熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems公司，型號：P 9700）。

結果判斷標準[6]：Gal-3、hTERT以已知陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。在高倍鏡下，隨機選取5個視野，若陽性細胞平均百分比＜5%為陰性，≥5%為陽性；BRAFV600E突變通過將PCR測序結果與基因庫中正常DNA序列比較，判斷有無突變。

1.3 研究方法 比較PTC癌組織及癌旁組織Gal-3、hTERT陽性率及BRAFV600E突變情況，分析癌組織Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變與PTC患者臨床病理特征的關系，統(tǒng)計癌組織Gal-3、hTERT表達及BRAFV600E突變陽性者及陰性者術后3年生存情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料以例和百分率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌組織及癌旁組織 Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變率比較 癌組織Gal-3、hTERT陽性率及BRAFV600E突變率皆高于癌旁組織（P＜0.05，表 1）。

表1 癌組織及癌旁組織Gal -3、hTERT陽性及BRAFV6OOE突變比較［n（%）］

2.2 Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變與臨床病理特征的關系 癌組織Gal-3陽性率在不同臨床病理特征患者間比較無顯著差異（P＞0.05）；癌組織hTERT陽性率及BRAFV600E突變率在不同性別、年齡、腫瘤直徑患者間比較無顯著差異（P＞0.05），但伴侵犯包膜、高腫瘤分期、伴淋巴結轉移者癌組織hTERT陽性率及BRAFV600E突變率較高（P＜0.05）。見表2。

表2 GaI-3、hTERT陽性及BRAFV6OOE突變與臨床病理特征的關系［n（%）］

2.3 Gal-3、hTERT表達及BRAFV600E突變陽性者與陰性者生存情況 術后3年時，83例Gal-3陽性表達者生存76例（91.57%），3例Gal-3陰性表達者全部生存，生存率為100.00%；56例hTERT陽性表達者生存51例（91.07%），30例hTERT陰性表達者生存28例（93.33%）；52例BRAFV600E突變者生存46例（88.46%），BRAFV600E未突變者生存 33 例（97.06%）。各Gal-3、hTERT表達及BRAFV600E突變陽性者與陰性者組間生存率比較均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

Gal-3為一種β-半乳糖苷結合的動物凝集素，與β-半乳糖親和力較好，可通過與特殊配體反應而發(fā)揮生物學效應。Gal-3在多種上皮細胞及免疫細胞中高表達，并參與信使核糖核酸(mRNA)剪切過程，具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡作用[7]。據(jù)文獻報道，具有無限分裂增殖能力的細胞均能不斷延伸其染色體端粒，這一能力由端粒酶介導，端粒酶能在端粒結合蛋白的輔助下，利用hTERT亞基的轉錄酶活性，催化延伸端粒，而維持長度[8]。故hTERT活化引起端粒酶激活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。BRAFV600E突變與PTC起始形成及發(fā)展預后密切相關，可激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，并通過三級激酶級聯(lián)反應方式傳遞至細胞核中，達到促進調節(jié)細胞增殖、生長的作用[9]。由此可見，上述3種蛋白表達、基因突變情況與PTC的發(fā)生、發(fā)展均有一定聯(lián)系。為此，本研究就PTC癌組織Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變情況展開分析，并探討其對預后的評估價值，為PTC的診療提供新思路。

本研究結果顯示，癌組織Gal-3、hTERT陽性率及BRAFV600E突變率皆比癌旁組織高，提示Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變對PTC的發(fā)生發(fā)展有重要作用。而癌組織Gal-3陽性率在不同臨床病理特征患者中對比無顯著差異，考慮該結果與PTC患者癌組織Gal-3陽性率較高，而本研究納入樣本量較少，使該項檢驗效能較低有關。但伴侵犯包膜、高腫瘤分期、伴淋巴結轉移者癌組織hTERT陽性率高，究其原因可能與hTERT的活化使端粒酶激活，并促進PTC腫瘤細胞增殖，促進腫瘤發(fā)展進程，而提高腫瘤細胞侵襲能力，增加腫瘤轉移及侵犯包膜風險。伴侵犯包膜、高腫瘤分期、伴淋巴結轉移者癌組織BRAFV600E突變率高，分析其原因可能與BRAFV600E突變導致MAPK通路激活，使通路中各因子激活至細胞核，并結合相應受體，介導基因的表達、編碼，進而參與細胞生長、發(fā)育、分化等生物學效應，達到調控腫瘤細胞增殖、侵襲性等作用有關。上述結果也提示，hTERT陽性、BRAFV600E突變可能通過調控PTC腫瘤細胞的侵犯包膜、腫瘤分期、淋巴結轉移情況，影響患者預后。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Gal-3、hTERT表達及BRAFV600E突變陽性者術后3年生存率略低于陰性者，但差異無統(tǒng)計學意義。推測該結果由兩個方面原因所致：一方面，本研究納入樣本量較少；另一方面，本研究隨訪時間較短，hTERT表達及BRAFV600E突變陽性與PTC侵犯包膜、腫瘤分期、淋巴結轉移情況關系密切，可能影響患者遠期預后。因此，Gal-3、hTERT表達及BRAFV600E突變陽性對PTC患者的預后影響還需進一步探討。

綜上所述，檢測Gal-3、hTERT陽性及BRAFV600E突變情況對PTC診療皆有利，hTERT陽性及BRAFV600E突變與PTC侵犯包膜、腫瘤分期、淋巴結轉移情況相關，但對仍需擴大隨訪時間，以進一步觀察其對預后的影響。