長期施肥下紅壤中類芬頓反應(yīng)及其對碳儲存的影響*

楊 柳 孫富生 王韜略 余光輝，2，3? 王伯仁 冉 煒 沈其榮

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇省固體有機廢棄物資源化高新技術(shù)研究重點實驗室，南京 210095）

（2 天津大學(xué)表層地球系統(tǒng)科學(xué)研究院，天津 300072）

（3 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（4 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，農(nóng)業(yè)部作物營養(yǎng)與施肥重點開放實驗室，北京 100081）

全球紅壤總面積約6 400 萬km2，占全球土地總面積的45.2%，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的發(fā)展中國家，紅壤地區(qū)人口總數(shù)約占全球總?cè)藬?shù)的一半以上［1］。據(jù)第二次土壤普查資料顯示，我國紅壤地區(qū)耕地占全國的30%，而68%的紅壤農(nóng)田屬于中低產(chǎn)田，耕地有機質(zhì)含量普遍偏低；同時，由于長期對土地的不合理利用，紅壤退化現(xiàn)象極為嚴(yán)重，特別是由于化肥的長期和過量施用，導(dǎo)致旱地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中紅壤有機碳含量呈現(xiàn)下降的趨勢［2］。土壤團聚體的物理保護(hù)作用［3］和礦物-有機復(fù)合體的形成［4-6］被認(rèn)為是土壤有機碳穩(wěn)定和累積的主要機制。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)的沉積物中，鐵氧化物可以結(jié)合/固定約21%的有機碳［7］。因此，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為酸性紅壤黏粒含量高及鐵鋁氧化物豐富的特點有利于有機碳的穩(wěn)定［8-9］；同時，富含的鐵、鋁礦物可以促進(jìn)微團聚體的形成，保護(hù)有機碳免受生物降解［10］。然而，同黑土、棕壤等相比，具有很強物理化學(xué)作用保護(hù)潛力的紅壤有機碳含量卻相對較低，并且在農(nóng)業(yè)耕作利用后表現(xiàn)出快速的退化趨勢。迄今為止，尚無合適的概念模型可以解釋亞熱帶紅壤上存在的這種矛盾現(xiàn)象。

芬頓反應(yīng)（Fenton reaction）是Fe(II)對H2O2的催化，須在酸性條件下進(jìn)行，H2O2利用效率低，反應(yīng)發(fā)生具有局限性，但氧化效率高。類芬頓反應(yīng)（Fenton-like reaction）是除Fe(II)以外，F(xiàn)e(III)、含鐵礦物以及其他一些過渡金屬如鈷（Co）、鎘（Cd）、銅（Cu）、銀（Ag）、錳（Mn）、鎳（Ni）等可以加速或者替代Fe(II)而對H2O2起催化作用的一類反應(yīng)的總稱，它具有適用pH范圍廣、催化劑種類多等優(yōu)點而廣泛發(fā)生于土壤中［11］。最近的研究表明，添加至土壤中的鐵卟啉在光照條件下可通過自由基機制增加土壤有機質(zhì)分子間共價鍵的形成，促進(jìn)土壤有機質(zhì)間的分子縮聚，進(jìn)而增加其穩(wěn)定性［12］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物普遍具有產(chǎn)生胞外超氧化物（O2

·-）的能力，這些O2·-在酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）［13-14］；雖然產(chǎn)生的O2·-和H2O2是弱氧化劑，但在環(huán)境中可以發(fā)生礦物催化的類芬頓反應(yīng)，進(jìn)一步形成非選擇性、氧化能力極強的羥基自由基（HO·）［15-16］。由于施用有機肥可激發(fā)土壤微生物活性、改變微生物群落結(jié)構(gòu)［17-18］，同時又提高了土壤中鐵礦物的可利用性［19］，因此，長期施肥處理可能通過改變紅壤的微生物群落結(jié)構(gòu)和鐵的可利用性而影響紅壤有機碳的固持。目前，國際上關(guān)于長期施肥處理影響紅壤中H2O2、HO·的含量及土壤固碳效應(yīng)等方面的研究尚未見報道。

鑒于此，本文依托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院湖南祁陽紅壤長期定位試驗站，通過設(shè)計一系列原位微宇宙試驗，研究1）長期施肥、微生物和作物根系分泌物對紅壤中H2O2、HO·和二價鐵［Fe(II)］的調(diào)控作用；2）土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)和類芬頓反應(yīng)的關(guān)聯(lián)；3）H2O2對土壤釋放CO2的貢獻(xiàn)；4）土壤-根的界面特征。研究結(jié)果將有助于深入理解紅壤易退化的機制，同時為提升紅壤有機物固持、保障國家糧食安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

湖南祁陽紅壤長期定位試驗站始建于1990年，具體地理位置為111°52′32″E，26°45′12″N，海拔約120 m，年平均溫度18.0℃，最高溫度36.6～40℃，年降水量1 250 mm，年蒸發(fā)量1 470 mm，無霜期約300 d，采用一年兩熟的小麥-玉米輪作模式［18］。供試土壤為第四紀(jì)紅土發(fā)育的紅泥土。2016年土壤的基本理化性質(zhì)如下：單施有機肥(M)處理，有機質(zhì)25.3 g·kg-1，pH 5.9，全碳13.4 g·kg-1，全鐵46.7 g·kg-1，可溶性有機碳（DOC）37.5 mg·kg-1；單施化肥（NPK）處理，有機質(zhì)18.5 g·kg-1，pH 4.6，全碳10.1 g·kg-1，全鐵55.4 g·kg-1，DOC 444.6 mg·kg-1。

微宇宙試驗于2016年12月（小麥播種后一個月）原位布置于M和NPK處理小區(qū)（圖1）。圖1從左至右依次為祁陽試驗田、試驗中所用的埋于土壤中的柱子和試驗完成后取出的柱子。

圖1 原位微宇宙試驗Fig.1 In situ microcosmic experiment

聚氯乙烯（PVC）柱子高15 cm、直徑7.5 cm，在柱身開2個大小相同的平行窗口，兩個窗口的表面積之和占總表面積1/2。在窗口上分別覆蓋3種不同孔徑的尼龍網(wǎng)來構(gòu)建不同處理，分別為0.45 μm、20 μm和1 000 μm。其中，0.45 μm尼龍網(wǎng)僅允許無機分子隨水分流動通過；20 μm尼龍網(wǎng)允許微生物、一部分小分子的有機物以及無機分子隨水分流動通過；1 000 μm尼龍網(wǎng)則允許植物根系、微生物、土壤中的有機無機分子隨水分的流動通過［19-20］。試驗啟動時，柱子內(nèi)裝1 kg試驗田的原位土，然后埋于該土壤區(qū)域內(nèi)。

1.2 土壤采集與基本理化性質(zhì)測定

土壤樣品2017年5月（小麥?zhǔn)崭钋耙恢埽⑺蠵VC柱子取回實驗室，將樣品預(yù)留為干濕兩部分，一部分置于陰涼處風(fēng)干，研磨過10目、20目和100目篩網(wǎng)；一部分鮮土保存于-80℃冰箱。

土壤基本理化性質(zhì)采用常規(guī)方法［21］測定。有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定；有效磷采用0.5 mol?L-1碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定；pH用pH計（PHS-3D，雷磁，上海）測定（水土比為1∶2.5）；全鐵經(jīng)過三酸（HNO3、HClO4和HF）消解［25］后利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）（安捷倫710/715，澳大利亞）檢測；全碳采用元素分析儀（Vario EL，Elementar Gmbh，哈瑙，德國）測定。土壤中Fe(II)采用鄰菲羅啉比色法檢測［22］；提取可溶性有機質(zhì)（DOM）后用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）（安捷倫710/715，澳大利亞）測定里面的可溶性鐵和DOC。

1.3 土壤中過氧化氫(H2O2)與羥基自由基(HO·)分析

采用文獻(xiàn)［23］的方法，準(zhǔn)確稱取過10目篩的新鮮土壤樣品1.0 g，置于15 mL離心管中，加4 mL 10 mmol?L-1磷酸輕輕倒轉(zhuǎn)浸提2 min， 5 000 g離心力下離心5 min，調(diào)節(jié)土壤提取液pH為6.5（用0.1 mol?L-1NaOH和HCl調(diào)節(jié)）。土壤過氧化氫吸光度的測定原理是在去除背景（磷酸鹽緩沖溶液（PBS））影響的前提下，將土壤提取液分別添加磷酸鹽緩沖液和過氧化氫酶，二者之間相差的過氧化氫吸光度進(jìn)行擬化所得到的過氧化氫濃度就是土壤中的過氧化氫濃度。

過氧化氫的吸光度（AH2O2）計算：

式中，AST1、AST2分別為土壤樣品加相同體積的磷酸鹽緩沖液和過氧化氫酶處理的吸光度；ARB1、ARB2分別為磷酸鹽緩沖液加相同體積的磷酸鹽緩沖液和過氧化氫酶處理的吸光度。

H2O2(0～2 μmol?L-1)標(biāo)準(zhǔn)曲線：用30% H2O2配成5 mmol?L-1H2O2溶液，用10 mmol?L-1PBS將5 mmol?L-1H2O2溶液稀釋成4 mol?L-1H2O2溶液作為母液，并按照0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 μmol?L-1的濃度梯度進(jìn)行稀釋。

利用對苯二甲酸(TPA)捕捉HO·生成熒光產(chǎn)物——羥基對苯二甲酸 (HTPA)［24］，然后，采用高效液相色譜儀(HPLC)檢測熒光物質(zhì)HTPA，從而間接測定HO·的含量［23］。準(zhǔn)確稱取過10目篩的新鮮土壤樣品1.0 g，置于15 mL離心管中，加4 mL 10 mmol?L-1H3PO4，充分搖勻5 min，在25℃以離心力4 200 g離心3 min，取上清液2 mL，在上清液中加入20 μL 100 mmol?L-1TPA，再在25℃黑暗避光條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后，將上清液過0.45 μm濾膜，取0.5 mL濾液置于棕色液相瓶中，隨后通過 HPLC(安捷倫1260，澳大利亞)配Eclipse XDB-C18 色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、熒光檢測器(FLD)測定。流動相用30%的甲醇（色譜純）配制50 mmol?L-1KH2PO4，pH 3.2（1 mol?L-1NaOH和1 mol?L-1HCl 調(diào)節(jié)），流速為 0.7 mL?min-1，F(xiàn)LD檢測器激發(fā)波長為 311 nm，發(fā)射波長為425 nm，柱溫25℃。HTPA與HO·反應(yīng)比例為1∶1，樣品中測定的HTPA 的值即為HO·的值。與此同時，應(yīng)將HTPA的標(biāo)準(zhǔn)樣品按照適宜的濃度梯度進(jìn)行稀釋，所得到的峰值與已知濃度進(jìn)行擬化，以方便樣品中HTPA的換算。

1.4 土壤排放二氧化碳潛力分析

準(zhǔn)確稱取過10目篩的新鮮土壤樣品1.0 g，置于25 mL的血清瓶中，加入10 mL40 nmol?L-1的H2O2，對照組加入10 mL水，過氧化氫現(xiàn)配現(xiàn)用。在血清瓶里充氮氣5～10 min，排出瓶內(nèi)空氣，將橡膠塞置于瓶口旁，隨著氮氣針頭的慢慢抽出及時蓋住瓶口，然后用錫蓋封住，用黑色塑料袋包裹，避光， 置于25℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，搖速為170 r?min-1。培養(yǎng)后，利用注射器和三通閥取氣，高效氣相色譜儀（GC，安捷倫7890A，澳大利亞）待測。

1.5 土壤中DNA提取和高通量測序分析

稱取0.5 g新鮮土壤，采用DNA提取試劑盒（MoBio Laboratories，加利福尼亞州，美國），參照其操作說明提取土壤樣品中總DNA，所得DNA于-20℃保存。DNA樣品通過Illumina MiSeq平臺（派森諾生物科技有限公司，上海）進(jìn)行16S rRNA測序。

1.6 根-土界面觀察

同步輻射紅外顯微成像（SR-FTIR）：收集NPK處理的通過1 000 μm孔徑的根際土壤，首先，采取噴霧方式噴灑蒸餾水，潤濕24 h，并盡量保持土壤顆粒的完整性［25］；然后，樣品在全封閉式快速冷凍切片機（CM1 950，徠卡，德國）內(nèi)的低溫（-20℃）條件下用水包埋后進(jìn)行超薄切片(厚度為2 μm)；最后，超薄切片樣品放置于低輻射鏡片（Low-E, 美國科弗里有限公司）上，帶至上海光源BL01B線站進(jìn)行紅外顯微成像觀察。面掃參數(shù)設(shè)置：光譜范圍，650～4 000 cm-1；步長，10 μm×10 μm；分辨率，4 cm-1；掃描次數(shù)，64次［25］；微區(qū)域精掃參數(shù)設(shè)置：光譜范圍，650～4 000 cm-1；步長，1 μm×1 μm；分辨率，4 cm-1；掃描次數(shù)，128次［26］。

掃描電子顯微鏡（SEM）觀察：同步輻射紅外顯微成像后的超薄切片樣品于磁控濺射鍍膜機（Ted Pella，加利福尼亞州，美國）噴金，并利用SEM（S-3400N II，日本日立公司）進(jìn)行形貌分

析［27］。

X射線光電子能譜（XPS）分析：收集NPK處理的通過1 000 μm孔徑的根際土和非根際土［28］，利用瑪瑙研缽研磨樣品至粒徑小于200 μm；然后，在配有Al Kα X射線輻射檢測器的PHI 5000 Versa Probe X射線能譜儀（UIVACPHI，日本）上進(jìn)行土壤顆粒表面的鐵形態(tài)分析。鐵的XPS譜以C 1s的結(jié)合能（284.6 eV）作為校正標(biāo)準(zhǔn)，利用XPSPEAK（Version 4.1）軟件進(jìn)行分峰處理［27］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 9.0和SPSS 20.0進(jìn)行圖形分析處理，使用最小顯著差異法( Least significant difference，LSD) 檢驗進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。高通量測序的多樣性指數(shù)，包括香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、辛普森指數(shù)（Simpson index）、豐富度指數(shù)（Chao 1 index、ACE index），以及微生物群落與環(huán)境因子的冗余分析（RDA）均采用R 3.1.0軟件運行。

2 結(jié) 果

2.1 長期施肥下紅壤中芬頓/類芬頓反應(yīng)發(fā)生的直接證據(jù)

經(jīng)過27 a的長期施肥，M處理的土壤未檢測到H2O2，而NPK處理的土壤H2O2濃度范圍約為0.4～0.8 nmol?g-1（圖2）。針對不同篩孔處理的NPK處理土壤而言，通過1 000 μm孔徑的土壤H2O2濃度最高，其次是通過20 μm孔徑的土壤，而通過0.45 μm孔徑的土壤H2O2濃度最低。同樣地，對于土壤中HO·而言，通過不同孔徑的M處理土壤HO·含量均顯著低于NPK處理的土壤。其中，M處理土壤和NPK處理土壤均是通過0.45 μm孔徑的土壤HO·含量最高，其次是通過20 μm孔徑的土壤，而通過1 000 μm孔徑的土壤HO·含量最低。對于土壤中Fe(II)而言，M處理的土壤Fe(II)含量顯著低于NPK處理土壤，其中，通過0.45 μm孔徑的土壤中差異尤其顯著，而在通過1 000 μm孔徑和20 μm孔徑的土壤之間差異相對較小。

綜上，長期施肥方式可以影響紅壤中芬頓/類芬頓反應(yīng)及其相關(guān)聯(lián)的H2O2、HO·及Fe(II)含量。同時，植物根系和微生物也對芬頓/類芬頓反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的H2O2、HO·及Fe(II)有一定程度的影響。

2.2 長期施肥下紅壤的CO2釋放潛力

為了評估芬頓/類芬頓反應(yīng)對長期施肥紅壤中CO2釋放潛力的影響，分別添加0.4 nmol?g-1當(dāng)量的H2O2至土壤中，對照處理添加相當(dāng)量的H2O；然后，在黑暗、避光環(huán)境中培養(yǎng)24 h，促進(jìn)土壤發(fā)生芬頓反應(yīng)。由圖3可知，在M處理的土壤中，添加H2O2和添加H2O培養(yǎng)的土壤釋放的CO2量并無顯著差異；而在NPK處理的土壤中，添加H2O2顯著促進(jìn)了CO2釋放量，該結(jié)果表明長期M處理的土壤具有很好的H2O2緩沖性能，而長期NPK處理的土壤可能發(fā)生了退化(如土壤有機質(zhì)含量低)，易于發(fā)生芬頓/類芬頓反應(yīng)，因而具有較差的H2O2緩沖性能。與NPK處理土壤相比，M處理土壤中通過1 000 μm孔徑和20 μm孔徑后釋放的CO2量更高，但通過0.45 μm孔徑的土壤釋放的CO2量并無顯著差別。

圖2 長期施肥土壤中H2O2、HO·、可溶性Fe及Fe(II)含量Fig.2 Concentrations of H2O2, HO·, dissolved Fe and Fe(II) in long-term fertilized soils

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與類芬頓反應(yīng)和CO2釋放的關(guān)聯(lián)

圖3 長期施肥紅壤中二氧化碳的釋放潛力Fig.3 Release potential of CO2 in long-term fertilized soils

表1 長期施肥紅壤的OTUs、群落豐度以及多樣性Table 1 Shift in OTUs, richness and diversity of long-term fertilized soils

基于土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的冗余分析（圖4）表明，RDA1及RDA2解釋量分別為83.9%和5.5%。其中RDA1將M與NPK處理土壤明顯分開。通過不同孔徑的M處理土壤中細(xì)菌群落聚集在一起，說明植物根系和微生物的進(jìn)入對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較??；而NPK處理的土壤中，通過0.45 μm孔徑與通過1 000 μm和20 μm孔徑的細(xì)菌群落差異較大，說明植物根系和微生物的進(jìn)入對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。M處理的細(xì)菌群落與土壤pH、DOC、可溶性Fe和CO2釋放呈正相關(guān)關(guān)系，說明M處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響了土壤pH、DOC、可溶性Fe和CO2釋放；而NPK處理的土壤細(xì)菌群落與土壤H2O2、HO·和Fe(II)呈正相關(guān)關(guān)系，說明NPK處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可能通過產(chǎn)生H2O2、還原態(tài)Fe(II)引發(fā)了土壤中的芬頓反應(yīng)，此外，F(xiàn)e(II)也可能貢獻(xiàn)了化學(xué)途徑生成H2O2和HO·。

2.4 芬頓/類芬頓反應(yīng)下的土壤-根的界面特征

圖4 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of soil bacterial communityand environmental factors

為研究植物根系的進(jìn)入對土壤芬頓/類芬頓反應(yīng)的影響，利用SEM結(jié)合SR-FTIR以及XPS技術(shù)研究了施用化肥處理通過1 000 μm孔徑土壤中的界面特征（圖5）。SEM（圖5A）表明所觀察的區(qū)域為土壤-根的接觸面, 接觸面上有一個明顯的斷區(qū)，上部較淺色區(qū)域為根系，且根系區(qū)域可以看出有明顯的根系紋理，而下部較深色區(qū)域為土壤顆粒；Fe 2p3/2XPS譜 （圖5B）表明，根的出現(xiàn)增加了土壤-根界面上Fe(II)比例，因此促進(jìn)了土壤芬頓反應(yīng)的發(fā)生；SR-FTIR（圖5C）表明，土壤-根界面上黏土礦物（3 619 cm-1）、脂肪碳（2 914 cm-1）、羧酸碳（1 725 cm-1）、羥基碳（1 135 cm-1）的分布模式有較大差異，其中，根的周圍含有高濃度的脂肪碳、羥基碳，而羧酸碳似乎已經(jīng)擴散至土壤顆粒中，因而根系的進(jìn)入為土壤提供了酸性環(huán)境，利于芬頓反應(yīng)的發(fā)生；土壤-根界面的微區(qū)FTIR圖（圖5 d）進(jìn)一步支持了SEM的觀察結(jié)果，即該區(qū)域為土壤-根的界面區(qū)域，其中，黏土礦物主要分布在觀察區(qū)域的邊緣，羥基碳分布在界面，而脂肪碳、羧酸碳分布在觀察區(qū)域的中心。

3 討 論

3.1 長期施肥處理對紅壤中芬頓/類芬頓化學(xué)反應(yīng)的影響

圖5 土壤-根界面觀察 a) 掃描電子顯微鏡（SEM）圖；b) Fe 2p3/2譜；c) 同步輻射紅外顯微成像（SR-FTIR）面掃圖；d) 微區(qū)域紅外顯微成像（FTIR）譜Fig.5 Soil - root interface observation.a) Scanning electronic microscopy (SEM) image; b) Fe 2p3/2 spectrum; c) Synchrotron radiation (SR)-based Fourier transform infrared (FTIR) mapping; d) Micro-FTIR (μ-FTIR)

最近研究表明，在特定條件下，土壤中芬頓或類芬頓化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的土壤有機碳分解量與生物分解量相當(dāng)［23］。然而，紅壤中芬頓或類芬頓化學(xué)反應(yīng)方面的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，紅壤中H2O2含量最高為0.7 nmol?g-1（圖2），該結(jié)果較Georgiou等［23］報道的希臘南部地區(qū)土壤中H2O2含量（～0.2 nmol?g-1）略高，但較沙漠土中的H2O2含量（5～19 nmol g-1）明顯偏低。同時，本研究發(fā)現(xiàn)與長期施用有機肥相比，長期施用化肥顯著增加了紅壤中H2O2和Fe(II)含量，而降低了可溶性Fe含量（圖2）。該結(jié)果表明，長期施用有機肥的紅壤由于增加了Fe的可溶性/可利用性，而類芬頓反應(yīng)（式（1）～式（2））為礦物催化的界面反應(yīng)，因此，可溶性Fe的增加促進(jìn)了類芬頓反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致了H2O2含量的降低。

與長期施用有機肥相比，長期施用化肥顯著增加了紅壤中Fe(II)、H2O2和HO·含量（圖2），該結(jié)果印證了長期施用化肥紅壤中芬頓反應(yīng)的發(fā)生（式（2））。RDA結(jié)果表明，H2O2與HO·顯著正相關(guān)（圖4），這與Lindsey和Tarr［29］在富里酸和胡敏酸體系中的研究結(jié)果一致。Page等［15］發(fā)現(xiàn)從干燥的高地到濕潤的低地棲息地，土壤中HO·的產(chǎn)生速率隨著Fe(II)和DOM濃度的增加而增加。Tong等［16］也認(rèn)為土壤中Fe(II)和可溶性有機質(zhì)（DOM）是生成HO·的主要因子。然而，上述研究均未涉及微生物的作用，本研究中RDA結(jié)果（圖4）同時表明H2O2與HO·的相關(guān)性是微生物介導(dǎo)的過程，且Fe(II)調(diào)控著施用化肥土壤內(nèi)芬頓反應(yīng)的進(jìn)行，是HO·產(chǎn)生的主要調(diào)控因子。

微生物通過影響土壤中鐵的地球化學(xué)循環(huán)過程進(jìn)而對土壤中H2O2產(chǎn)生影響。施肥改變了土壤的基本性質(zhì)［19］，對土壤微生物的豐度和多樣性也有著強烈的影響(表1)。采用穩(wěn)定同位素原位標(biāo)記土壤微生物核酸RNA的方法，Ding等［30］的研究結(jié)果表明，長期施用化肥處理的土壤可以顯著提高鐵還原能力，而Wen等［18］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，長期施用化肥顯著改變了紅壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微生物和針鐵礦的氧化還原過程中形成更高比例的Fe(II)。因此，與長期施用化肥的紅壤相比，長期施用有機肥的紅壤中Fe(II)含量較低，導(dǎo)致非生物形成H2O2的量較少［15］。

除了鐵化學(xué)和微生物外，有機質(zhì)含量也會影響土壤中H2O2。Petigara等［31］發(fā)現(xiàn)在有機質(zhì)或錳含量高的土壤中，H2O2降解迅速，且形成的產(chǎn)物HO·較少 (小于10%)；而在有機質(zhì)含量低的土壤中，H2O2降解緩慢，且HO·為主要產(chǎn)物。因此，長期施用有機肥的紅壤中高的有機質(zhì)含量是其H2O2迅速降解的原因之一。在今后的研究中，不同深度、不同季節(jié)、不同土壤性質(zhì)（例如DOM ）對過氧化氫、羥基含量的影響應(yīng)該重點關(guān)注。

3.2 類芬頓化學(xué)反應(yīng)對長期施肥紅壤碳排放的影響

土壤中產(chǎn)生的CO2是微生物代謝等一系列生物化學(xué)過程的綜合產(chǎn)物，其主要來自土壤微生物和植物根系的呼吸作用。本研究發(fā)現(xiàn)無論添加水或者雙氧水培養(yǎng)，長期施用有機肥的土壤排放的CO2顯著較長期施化肥土壤的多，且植物根系和微生物能參與作用的土壤（1 000 μm）排放的CO2要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于僅能通過水分子和無機離子的土壤（0.45μm）（圖3），可能是由于長期施用有機肥的土壤較長期施化肥的土壤生物量大的緣故［17-18］。同時，研究結(jié)果表明在長期施用化肥的土壤中，添加0.4 nmol·g-1當(dāng)量的H2O2會顯著促進(jìn)土壤CO2的排放；而在長期施用有機肥的紅壤中，添加該當(dāng)量的H2O2則不會顯著促進(jìn)土壤CO2的排放(圖3)。由于芬頓反應(yīng)在酸性條件下效果顯著高于中性或近中性條件，因此，長期施用化肥的土壤由于pH偏低，易于發(fā)生芬頓反應(yīng)而形成強氧化性的產(chǎn)物HO·，HO·進(jìn)一步氧化土壤有機碳，排放CO2，導(dǎo)致有機碳快速分解；而長期施用有機肥的土壤則利用它的中性土壤環(huán)境減緩芬頓反應(yīng)而累積有機碳。此外，土壤排放的CO2量與HO·、H2O2及Fe(II)含量成負(fù)相關(guān)關(guān)系。在芬頓反應(yīng)機制中，H2O2催化Fe(II)生成產(chǎn)物HO·和Fe(III)，羥基自由基是目前已知氧化性最強的活性氧自由基，其氧化還原電位達(dá)2.7 V，反應(yīng)速率常數(shù)一般高于107mol·L-1·s-1，它能氧化土壤有機質(zhì)，排放出CO2、N2O等溫室氣體。

綜上，長期施化肥的土壤內(nèi)部環(huán)境利于芬頓反應(yīng)的進(jìn)行，所生存的微生物促進(jìn)鐵的還原過程；長期施有機肥的土壤內(nèi)部微生物對Fe(II)氧化過程有相對積極的作用，使得土壤具有顯著抑制鐵還原能力，能夠有效抑制或減緩芬頓反應(yīng)，進(jìn)一步使土壤中的有機碳得到累積。

3.3 微生物介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)：對紅壤有機碳固持的啟示

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，微生物通過胞外酶的作用分解有機物，原有的和分解的有機物與土壤中礦物作用，形成礦物-有機復(fù)合體，導(dǎo)致土壤有機碳穩(wěn)定與累積［9］。但該觀點難以有效解釋黏粒含量高及鐵鋁氧化物豐富的亞熱帶紅壤中有機碳含量低且退化嚴(yán)重的現(xiàn)象?；陂L期定位試驗站和原位微宇宙試驗的研究結(jié)果，本文提出了有效增加亞熱帶紅壤有機碳的概念模型(圖6)。具體而言，紅壤通過施用有機物（如畜禽糞便、秸稈、有機肥），激發(fā)土壤中的微生物［17-18］，增加紅壤中鐵礦物的可利用性［19］。由于土壤微生物普遍具有產(chǎn)生O2·-的能力［13-14］，導(dǎo)致鐵氧化物含量豐富的紅壤發(fā)生類芬頓反應(yīng)，形成分子內(nèi)共價鍵而促進(jìn)了土壤有機碳的穩(wěn)定性［11-12］。同時，可利用鐵快速轉(zhuǎn)化為比表面積大、活性高的非晶形水鐵礦［19］，促進(jìn)了礦物-有機復(fù)合體的形成［4］，增加了紅壤有機碳穩(wěn)定與累積。

4 結(jié) 論

基于長期定位試驗站結(jié)合原位微宇宙試驗，對亞熱帶紅壤中H2O2、HO·、鐵化學(xué)、微生物群落結(jié)構(gòu)及其土壤-根界面過程進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，長期施用化肥的紅壤中H2O2、HO·及Fe(II)含量均顯著高于長期施用有機肥，根系分泌物和微生物的參與也能夠調(diào)控H2O2、HO·和Fe(II)含量，且H2O2和HO·含量呈線性關(guān)系。長期施用有機肥的紅壤具有很好的H2O2緩沖性能，其細(xì)菌群落影響了土壤pH、DOC、可溶性Fe和CO2釋放；而長期施用化肥的紅壤具有較差的H2O2緩沖性能，其細(xì)菌群落可能通過產(chǎn)生H2O2、還原態(tài)Fe(II)引發(fā)了土壤中的芬頓反應(yīng)。與長期施用化肥的紅壤相比，長期施用有機肥的紅壤中通過1 000 μm孔徑和20 μm孔徑后釋放的CO2量更高，但通過0.45 μm孔徑的土壤釋放的CO2量并無顯著差別。土壤-根界面上黏土礦物（3 619 cm-1）、脂肪碳（2 914 cm-1）、羧酸碳（1 725 cm-1）、羥基碳（1 135 cm-1）的分布模式有較大差異，其中，根的周圍含有高濃度的脂肪碳、羥基碳。根的出現(xiàn)增加了土壤-根界面上Fe(II)比例。提出了有效增加亞熱帶紅壤有機碳的概念模型。具體而言，通過施用有機物（如畜禽糞便、秸稈、有機肥），激發(fā)紅壤中的微生物和鐵礦物的可利用性，促進(jìn)芬頓或類芬頓反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而形成分子內(nèi)共價鍵和礦物-有機復(fù)合體而促進(jìn)紅壤有機碳穩(wěn)定與累積。

圖6 微生物介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)影響了紅壤中碳儲存Fig.6 Microbial - mediated Fenton-like reactions affect soil C storage