采用熒光光譜法研究DDAF與BSA的相互作用

王秀文 王穎莉 于茜 裴曉麗

摘要：研究新型反離子季銨鹽DDAI與BSA的相互作用。通過單因素法，選出適宜的作用時(shí)間、Na濃度和pH值;并采用熒光光譜法和三維熒光光譜法研究DDAF與BSA的相互作用機(jī)制。作用時(shí)間15min，鈉離子濃度為0.04mol/L、pH值為待測(cè)液的初始pH值為適宜的實(shí)驗(yàn)條件;不同溫度（290.15，296.15，303.15，310.15K）下二者的雙分子猝滅常數(shù)（K_q）分別為7.03×10¹⁰，8.53×10¹⁰，1.09×10¹¹，1.12×10¹¹L/（mol-s）;結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）分別為1.17、0.84、0.97和1.02; AH和AS均大于0;三維熒光光譜顯示，加入DDAF后，BSA的熒光峰發(fā)生藍(lán)移，且熒光強(qiáng)度下降16.63%。DDAF和BSA為混合猝滅;二者以1：1結(jié)合;二者間的作用力是疏水作用力;DDAF使BSA氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：雙癸基二甲基甲酸鉸;牛血清白蛋白;熒光光譜法;三維熒光光譜法

中圖分類號(hào)：TQ423：0657.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2019）07-0080-07

收稿日期：2018-11-23;收到修改稿日期：2019-01-15

基金項(xiàng)目：山西省留學(xué)回國人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（2017066）;太原科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金（20162015）;山西省"1331工程”工程（技術(shù)）研究中心建設(shè)計(jì)劃（晉教科[20]7]14號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：王秀文（1981-），女，山西太谷縣人，講師，碩士，主要從事中藥及其制劑的質(zhì)量研究。

通信作者：王穎莉（1967-），女，山西太原市人，教授，博士，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作。

0 引言

雙癸基二甲基甲酸銨（DDAF）是中國日用化學(xué)研究院有限公司合成的一種新型反離子季銨鹽表面活性劑，屬于陽離子表面活性劑。其陽離子部分為季銨鹽，反離子為甲酸根（-HCOO-），化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。DDAF在水溶液中電離而帶正電荷，可以吸附在帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，影響細(xì)胞膜正常生理功能，具有良好的殺菌效果[1]。唐偉月等[2]研究表明，DDAF僅需10μg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率即可達(dá)到100%。該機(jī)構(gòu)還研制了含DDAF的洗手液配方[1]，其抑菌性能達(dá)到GB 19877.1-、2005關(guān)于洗手液抑菌率不低于50%的要求。此外DDAF泡沫少、易降解，在抑菌清洗液方面有良好的開發(fā)前景[1]。

蛋白質(zhì)是細(xì)胞的重要成分，是生命的基本物質(zhì)，表面活性劑的殺、抑菌活性與蛋白質(zhì)的相互作用是緊密相關(guān)的。研究表面活性劑與蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)深入了解表面活性劑的殺、抑菌作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)以及毒理研究具有重要意義。其次，表面活性劑對(duì)皮膚的刺激作用，對(duì)頭發(fā)、羊毛的柔順作用等，都涉及到表面活性劑與蛋白質(zhì)的相互作用，在工業(yè)、生物、制藥和化妝品等領(lǐng)域中具有廣泛意義[3-4]。

目前國內(nèi)對(duì)于DDAF的研究不多[1-2，5-6]，也未曾發(fā)現(xiàn)有DDAF與BSA（牛血清白蛋白）相互作用的研究，因此本文采用熒光光譜法和三維熒光光譜法研究DDAF與BSA的相互作用，希望為擴(kuò)大DDAF的應(yīng)用范圍提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)（F97 pro熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司）;智能酸度計(jì)（pHS-4C⁺，成都世紀(jì)方舟科技有限公司）;水浴鍋（數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2，金壇市杰瑞爾電器有限公司）;萬分之一分析天平（JM-B-2003，余姚紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

牛血清白蛋白（生物技術(shù)級(jí)，96%，AladdinIndustrial Corporation）;DDAF（由中國日用化學(xué)研究院有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)84%）;高純水（市售娃哈哈純凈水）;氯化鈉（分析純，北京康普匯科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

1.0×10^-4mol/L BSA溶液的配制：用萬分之一分析天平準(zhǔn)確稱取約0.7g BSA樣品，置于小燒杯內(nèi)，用高純水溶解，定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，定容，搖勻。

2.06×10^-4mol/L DDAF溶液的配制：將DDAF樣品搖勻（動(dòng)作要輕、慢，防止氣泡夾入），用1mL移液管準(zhǔn)確移取0.1mL該樣品，置于小燒杯中，用高純水稀釋，洗滌移液管內(nèi)壁3次，定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，定容，搖勻，制成2.06×10^-3mol/LDDAF的儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取10mL儲(chǔ)備液至100mL容量瓶，用高純水定容，搖勻，即得。

0.1mol/L NaCl溶液的配制：用萬分之一分析天平準(zhǔn)確稱取約5.85g氯化鈉，用高純水溶解，定量轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶，定容，搖勻。

上述溶液均放入4℃冰箱中保存，使用前取出，放至室溫使用。

1.2.2 熒光光譜的測(cè)量條件

熒光發(fā)射光譜測(cè)量條件：激發(fā)波長(zhǎng)283nm，掃描波長(zhǎng)范圍為290～450nm，掃描步長(zhǎng)1nm，激發(fā)帶寬10nm，發(fā)射帶寬5nm，增益中（650V），掃描次數(shù)為3次。

三維熒光光譜測(cè)定條件：激發(fā)光波長(zhǎng)范圍為200～500nm;發(fā)射光波長(zhǎng)范圍為200～500nm：激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5mm;激發(fā)光波長(zhǎng)掃描間隔為5nm;掃描步長(zhǎng)1nm。

每次測(cè)定前，均要用高純水潤(rùn)洗石英比色皿3次，再用待測(cè)液潤(rùn)洗2～3次，每次測(cè)量均用同一比色皿。

2 結(jié)果與討論

2.1 DDAF與BSA相互作用適宜條件的研究

2.1.1 不同濃度DDAF對(duì)BSA的熒光強(qiáng)度的影響

取編號(hào)為0～7號(hào)的10mL容量瓶，用1mL移液管分別準(zhǔn)確移取1mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液，再用10mL移液管分別移入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0ml，2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，最后用高純水定容，搖勻，靜置15min，用熒光分光光度計(jì)，按照1.2.2項(xiàng)下熒光發(fā)射光譜測(cè)量條件，測(cè)量待測(cè)液中BSA的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見表1和圖2。

從表1和圖2可以看出，隨著DDAF濃度的升高，BSA的熒光強(qiáng)度從503.6降至418.7，并且最大發(fā)射波長(zhǎng)由342.3nm藍(lán)移到333.3nm，說明DDAF對(duì)BSA有猝滅作用[7]。BSA分子的熒光發(fā)射光譜在270～350nm有吸收，這種吸收主要來自色氨酸（Ttp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基。Ttp、Tyr和Phe產(chǎn)生不同的熒光光譜，其熒光峰（λ_max）分別位于348nm、303nm和282nm，熒光強(qiáng)度比約為100：9：0.5，即Trp的熒光強(qiáng)度最大，因而可以認(rèn)為342.3mm的熒光峰主要由Ttp所產(chǎn)生的[8]。熒光峰發(fā)生藍(lán)移說明蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)向了一個(gè)更加疏水的環(huán)境，說明DDAF結(jié)合在了BSA的Trp殘基附近，導(dǎo)致7知?dú)埢車h(huán)境的疏水性增強(qiáng)。

2.1.2 作用時(shí)間對(duì)BSA/DDAF相互作用的影響

取編號(hào)為0、1的100mL容量瓶，準(zhǔn)確吸取10mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液于。號(hào)容量瓶，用高純水定容至刻度;并準(zhǔn)確吸取10mL 1.0×10^-4mol/LBSA溶液于1號(hào)容量瓶，再準(zhǔn)確吸取10mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容至刻度。全部待測(cè)液配完后開始計(jì)時(shí)，按照1.2.2項(xiàng)下熒光發(fā)射光譜測(cè)量條件，分別測(cè)量靜置0，15，30，45，60，75，90，105，120min后待測(cè)液的熒光強(qiáng)度。測(cè)得的結(jié)果如圖3所示。

由圖可知，在0～120min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，未加入和加入DDAF的兩組待測(cè)液中BSA的熒光強(qiáng)度分別基本維持在497、480左右，可能是二者相互作用的速度較快，且二者的復(fù)合物比較穩(wěn)定。理論上說后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可以在溶液配完之后立即檢測(cè)，但考慮到后續(xù)研究作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)需要保溫，為盡量避免無關(guān)因素的干擾，選擇15min作為每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的適宜反應(yīng)時(shí)間。

2.1.3 鈉離子濃度對(duì)BSA/DDAF體系熒光強(qiáng)度的影響

離子強(qiáng)度對(duì)DDAF和BSA的相互作用具有一定影響，本文研究了NaCl濃度對(duì)DDAF和BSA的相互作用的影響。取A、B兩組編號(hào)均為0-8的 10mL容量瓶，A組用1mL移液管準(zhǔn)確移入1.0mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液，再分別準(zhǔn)確移入0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mL 0.1mol/L NaCl溶液，高純水定容，搖勻。B組按上述操作加入1.0×10^-4mol/L BSA和0.1mol/L NaCl溶液，再加入1mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容，搖勻，靜置15min，按照1.2.2項(xiàng)下熒光發(fā)射光譜測(cè)量條件，測(cè)定待測(cè)液的熒光強(qiáng)度，所得結(jié)果見圖4。

從圖中可以看出，鈉離子濃度在0～0.04mol/L區(qū)間時(shí)，隨著離子濃度的升高，A組待測(cè)液的熒光強(qiáng)度逐漸由483.4上升到503.4，上升了20個(gè)單位，而B組待測(cè)液熒光強(qiáng)度則由463.4上升到493.34，上升了30個(gè)單位。這說明NaCl的存在可能不僅會(huì)影響B(tài)SA本身的熒光強(qiáng)度，也影響了DDAF與BSA的結(jié)合，文獻(xiàn)[9]也報(bào)道過類似情況。同時(shí)可以看出，鈉離子濃度達(dá)到0.04mol/L時(shí)，隨著離子濃度的升高，A、B兩組待測(cè)液的熒光強(qiáng)度分別基本穩(wěn)定在503、493，這說明鈉離子對(duì)BSA/DDAF的影響達(dá)到飽和。因此，選用0.04mol/L NaCl溶液作為適宜的鈉離子強(qiáng)度。

2.1.4 不同酸堿度對(duì)BSA/DDAF體系熒光強(qiáng)度的影響

取編號(hào)為0～5的100mL容量瓶，均準(zhǔn)確移入10mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液和40mL 0.1mol/LNaCl溶液，再分別準(zhǔn)確移入0，10，20，30，40，50mL2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容，搖勻，靜置15min。分別準(zhǔn)確吸取30mL止此待測(cè)液，置于A、B兩組50mL燒杯中，A燒杯中適量滴加0.1mol/L HCl溶液，調(diào)節(jié)待測(cè)液pH值分別為2.7、3.7、4.7、5.7、6.7（待測(cè)液的原始pH值），B燒杯中滴加適量0.1mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)待測(cè)液的pH值分別為7.4、7.7、8.7、9.7、10.7、按照1.2.2項(xiàng)下熒光發(fā)射光譜測(cè)量條件，分別測(cè)量待測(cè)液的熒光強(qiáng)度，所得結(jié)果見表2和圖5。

可以看出，未加入猝滅劑的待測(cè)液中，當(dāng)pH值為5.7時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度最強(qiáng);當(dāng)pH值在4.7～7.7范圍內(nèi)BSA的熒光強(qiáng)度大而且較為穩(wěn)定;當(dāng)pH值在2.7～4.7范圍內(nèi)，隨著待測(cè)液酸性的增強(qiáng)，體系的熒光強(qiáng)度均下降;當(dāng)pH為7.7～10.7范圍內(nèi)，隨著待測(cè)液堿性的增強(qiáng)，體系的熒光強(qiáng)度也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)，但后者的降幅比前者大。這可能是因?yàn)樘烊坏腂SA等電點(diǎn)為pH4.6～4.8[10-12]，而體系中加了0.04mol/L的NaCl溶液，可能使BSA的等電點(diǎn)升高[13]到pH5.7附近，此時(shí)BSA以分子狀態(tài)存在，比較穩(wěn)定，因此熒光最強(qiáng)，而過量的酸堿會(huì)使BSA的分子存在狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，并且可以看出堿性環(huán)境對(duì)于BSA熒光強(qiáng)度的影響較大。

當(dāng)加入2.06×10^-5mol/L DDAF溶液后，在pH值為2.7、3.7、4.7、5.7、6.7時(shí)，待測(cè)液的熒光強(qiáng)度與未加入DDAF時(shí)的熒光強(qiáng)度差值分別為8.6、7.7、4.6、6.2、7.8、而當(dāng)pH值為7.4、7.7、8.7、9.7、10.7時(shí)，差值分別為12.3、13.4、47.4、22.5、35.3。由此可看出堿性環(huán)境下，DDAF對(duì)于BSA的猝滅作用較強(qiáng)?？赡苁且?yàn)镈DAF屬于季銨鹽陽離子表面活性劑，堿性環(huán)境有利于含氮陽離子部分的解離，從而增強(qiáng)DDAF對(duì)于BSA熒光的猝滅作用。由于pH在4.7～7.7范圍內(nèi)，BSA的熒光強(qiáng)度大而且較為穩(wěn)定，又由于BSA初始pH值為6.7、在此范圍之內(nèi)，考慮到實(shí)驗(yàn)操作的簡(jiǎn)化，選擇BSA的初始pH值即pH6.7為適宜的pH值。

2.2 DDAF與BSA相互作用機(jī)理的研究

2.2.1 DDAF對(duì)BSA熒光猝滅機(jī)制的研究

取A、B、C、D4組編號(hào)為0～5的10mL容量瓶，每組加入1mL 1.0×10^-4mol/L BSA溶液和4.0mL 0.1mol/L NaCl溶液，每組再分別加入0～5mL 2.06×10^-4mol/L DDAF溶液，用高純水定容，搖勻，A、B、C、D4組分別在290.15 K、296.15K、303.15K、310.15K下保溫15min，按照1.2.2項(xiàng)下熒光發(fā)射光譜測(cè)量條件，測(cè)定待測(cè)液的熒光強(qiáng)度，所得結(jié)果如表3所示。

采用Stern-Volmer方程[14]處理數(shù)據(jù)：

F₀/F=1+K_qτ₀[Q]=1+K_SV[Q]（1）式中F₀為未加入DDAF時(shí)BSA的熒光值;F為加入DDAF后BSA的熒光值;[Q]表示DDAF的摩爾濃度;K_q為雙分子猝滅速率常數(shù);τ₀表示生物大分子的平均壽命，約為1×10^-8s：K_SV表示Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。以F₀/F為縱坐標(biāo)，[Q]為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖6。計(jì)算不同溫度下（290.15，296.15，303.15，310.15K）DDAF對(duì)BSA的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，結(jié)果見表4。

常見的猝滅類型有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度升高而降低，但均大于2.0×10¹⁰L/（mol·s），動(dòng)態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大[15]。由表4可知，在290.15K、296.15K、303.15K和310.15K下，雙分子猝滅常數(shù)K_q分別為7.03×10₁₀，8.53×10¹⁰，1.09×10¹¹，1.12×10¹¹L/（mol·s），均大于2.0×10¹⁰L/（mol·s），是靜態(tài)猝滅，但隨溫度升高，K_q值卻一直上升，又是動(dòng)態(tài)猝滅的現(xiàn)象。文獻(xiàn)也報(bào)道過類似情況，認(rèn)為是混合機(jī)制[16]，因此，DDAF與BSA的相互作用可能也是動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅的混合機(jī)制所致。

2.2.2 DDAF與BSA作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)的確定

結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)是研究物質(zhì)與BSA相互作用的重要參數(shù)。熒光強(qiáng)度和猝滅劑的關(guān)系可用修正的Stern-Volmer雙對(duì)數(shù)方程來描述[17]，即：

1g[（F₀-F）/F]=1gK_a+nlg[Q]（2）式中F₀為未加入DDAF時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度;F表示加入不同濃度DDAF后BSA的熒光強(qiáng)度;K_a為結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù);[Q]為DDAF的摩爾濃度。以lg[（F₀-F）/F]對(duì)1g[Q]作圖，如圖7所示。由直線的斜率和截距可計(jì)算出相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)n和結(jié)合常數(shù)K_a，所得結(jié)果見表5。

由表5可知，在290.15K、296.15K、303.15K和310.15K下，結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級(jí)在10³左右，說明DDAF與BSA的結(jié)合較弱;4個(gè)溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.17、0.84、0.97、1.02，都接近1，說明DDAF與BSA的結(jié)合比為1：1。

2.2.3 DDAF與BSA相互作用力的研究

有機(jī)小分子與生物大分子的相互作用力可用如下3個(gè)熱力學(xué)函數(shù)來判斷：

△G=-RT1nKa（3）

△G=△H-T△S（4）

ln[K_a2/K_a1]=[1/T₁-1/T₂]△H/R（5）

計(jì)算結(jié)果見表6，由表可知，△G都小于0，說明DDAF與BSA的相互作用是在自發(fā)條件下進(jìn)行的;△H和△S均大于0，表明DDAF和BSA的相互作用力是典型的疏水作用力[18]。

2.2.4 DDAF對(duì)BSA構(gòu)型的影響研究

三維熒光光譜是以激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、熒光強(qiáng)度分別為X、Y和Z軸，所得到的熒光圖譜，能夠更加全面反映待測(cè)品的熒光信息[19]。可以借此研究DDAF對(duì)BSA構(gòu)型的影響。

取0和1號(hào)10mL容量瓶，分別準(zhǔn)確加入1mL1.0×10^-4mol/L BSA溶液和4mL 0.1mol/L NaCl溶液，并在1號(hào)瓶中加入5mL 2.06×10^-4mol/L DDAF，0和1號(hào)容量瓶均用高純水定容，搖勻，靜置15min后，用熒光分光光度計(jì)，按照1.2.2項(xiàng)下三維熒光光譜測(cè)量條件，測(cè)定待測(cè)液的熒光強(qiáng)度。所得數(shù)據(jù)見表7，待測(cè)液的三維熒光光譜見圖8。

熒光峰反映了BSA中氨基酸的疏水環(huán)境[20]，由表7可知，加入DDAF后，BSA的熒光峰的強(qiáng)度下降了16.63%，說明DDAF對(duì)BSA分子中的氨基酸殘基有影響;最大發(fā)射波長(zhǎng)由343nm藍(lán)移到336nm，說明DDAF的加入會(huì)使BSA分子中的氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強(qiáng)。

3 結(jié)束語

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)，選定作用時(shí)間為15min;鈉離子濃度為0.04mol/L;待測(cè)液的初始pH值為適宜的實(shí)驗(yàn)條件;并且，可以看出pH對(duì)于DDAF/BSA體系的熒光強(qiáng)度影響最大，鈉離子的影響次之，作用時(shí)間的影響最小。在上述適宜實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行DDAF與BSA相互作用的研究，認(rèn)為DDAF對(duì)BSA熒光猝滅的機(jī)制可能為混合猝滅;二者以1：1結(jié)合;二者間的作用力是典型的疏水作用力。三維熒光光譜表明，DDAF的加入使得BSA氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強(qiáng)。

本文采用熒光光譜法和三維熒光法研究了DDAF與BSA相互作用，研究結(jié)果表明，DDAF與BSA會(huì)形成靜態(tài)復(fù)合物，而且DDAF的加入使得BSA氨基酸殘基周圍的疏水環(huán)境增強(qiáng)，這些均表明DDAF的加入可能使得BSA化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的生理功能。這為 DDAF殺、抑菌作用機(jī)制的研究提供了一些有益的結(jié)論。另外，由于條件及時(shí)間有限，我們對(duì)于DDAF與BSA相互作用及研究?jī)H僅采用了熒光光譜法及三維熒光光譜法，我們將在以后采用紫外分光光度法、同步熒光法、圓二色相光譜法等等方法來進(jìn)一步研究。

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（編輯：莫婕）