黑逍遙散對阿爾茨海默病模型小鼠Ca²⁺-CaM/CaMKⅡα信號通路關鍵因子表達的影響

馬春林 吳紅彥 蘭美華 程堅 段永強

摘要：目的? 觀察黑逍遙散對阿爾茨海默?。ˋD）小鼠海馬神經元Ca2+濃度和鈣調蛋白（CaM）、鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱα（CaMKⅡα）表達的影響。方法? 30只APP/PS1雙轉基因雄性小鼠稱重后，按隨機原則分為模型組、陽性對照組和黑逍遙散組，每組10只。另取10只同月齡、同種系野生型C57BL/6雄性小鼠為空白組。各給藥組給予相應藥物干預，連續(xù)3個月，采用鈣熒光探針結合激光共聚焦顯微鏡技術檢測海馬神經元Ca2+濃度，采用實時熒光定量PCR和免疫組化技術分別檢測小鼠海馬區(qū)CaM、CaMKⅡα基因和蛋白的表達。結果? 與空白組比較，模型組小鼠海馬神經元Ca2+濃度顯著升高，CaM基因和蛋白表達顯著升高，CaMKⅡα基因和蛋白表達顯著降低（P<0.01，P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬神經元Ca2+濃度顯著降低，CaM基因和蛋白表達顯著降低，CaMKⅡα基因和蛋白表達顯著升高（P<0.01，P<0.05）。結論? 黑逍遙散通過調節(jié)模型小鼠海馬Ca2+-CaM/CaMKⅡα信號通路關鍵因子表達而發(fā)揮防治AD的作用。

關鍵詞：黑逍遙散;阿爾茨海默病;海馬組織;Ca2+濃度;鈣調蛋白;鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱα;小鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0050-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.012????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Heixiaoyao Powder on the concentration of Ca2+ and expressions of calmodulin， CaMKⅡα αgenes or proteins in the hippocampus neurons of Alzheimer disease （AD） mice. Methods After weighing， 30 APP/PSI genetically modified mice were randomly divided into model group， positive medicine control group， and Heixiaoyao Powder groups， with 10 mice in each group. Ten wild-type C57BL/6 male mice of the same age and same species were set as blank group. Each administration group was given relevant medicine. After three-month successive gavage， calcium fluorescence probe combined with laser confocal microscopy was used to detect the Ca2+ concentration in hippocampal neurons， and real-time quantitative PCR and immuno- histochemistry were used to detect the expressions of CaM and CaMKⅡα genes and proteins in hippocampus of mice. Results Compared with the blank group， the Ca2+ concentration in the hippocampal neurons of the model group significantly increased， and the expressions of CaM gene and protein were significantly increased， while the expressions of CaMKⅡα gene and protein were decreased （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model group， the concentration of Ca2+ in hippocampal neurons of mice significantly decreased. The expressions of CaM gene and protein were significantly decreased， while the expressions of CaMKⅡα gene and protein were significantly increased （P<0.01， P<0.05）. Conclusion Heixiaoyao Powder can prevent and treat AD by regulating the concentration of Ca2+-CaM/CaMKⅡα signal pathway in the hippocampus of model mice.

Keywords： Hei Xiaoyao Powder; Alzheimer disease; hippocampus; Ca2+; CaM; CaMKⅡα; mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種增齡性的神經退化性疾病，以大腦皮層退化導致記憶力、判斷力、抽象思維力、推理能力及情感反應障礙和性格改變?yōu)橹饕R床特征[1]。據報道，目前全世界癡呆患者約有4680萬人，而我國占比超過l/4，隨著我國老齡化趨勢的加速，如缺乏有效防治措施，AD患者必將迅速增加[2]。研究表明，AD發(fā)病時腦神經元存在鈣穩(wěn)態(tài)失衡[3]。Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB是中樞神經系統學習記憶形成與維持的重要信號轉導通路[4]，其中Ca2+是一種重要的第二信使，參與多種細胞生理生化過程[5];鈣調蛋白（CaM）是胞內重要的信號傳導分子，與Ca2+結合形成Ca2+/CaM復合物，通過激活下游分子參與學習記憶等多種生理學效應[6];鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱα（CaMKⅡα）是胞內參與鈣信號轉導的一種依賴于Ca2+的酶類，廣泛參與基因轉錄調節(jié)、骨架蛋白磷酸化，其活性異常可能是AD的發(fā)病機制之一[7]。Ca2+-CaM可誘導CaMKⅡ發(fā)生分子構像改變，在Thr286位點出現磷酸化，活化的CaMKⅡ可激活神經元胞核內轉錄機制，從而調控神經元胞內或胞膜的酶類或受體成分的合成[8]。本課題組前期已應用基因芯片檢測大鼠基因表達譜改變，部分差異表達基因聚類分析提示，黑逍遙散干預AD大鼠與Ca2+-CaM/CaMKⅡ信號通路有關[9]。因此，本實驗從Ca2+-CaM/CaMKⅡ信號通路探討黑逍遙散對APP/PSI雙轉基因小鼠海馬區(qū)CaM、CaMKⅡα因子的干預作用，為該方防治AD的研發(fā)提供依據。

1? 實驗材料

1.1? 動物

雄性SPF級APP/PS1雙轉基因小鼠30只，4月齡，體質量（25±5）g，同月齡、同種系雄性小鼠10只，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2014-0004。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，溫度20 ℃、濕度40%，晝夜交替12 h，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

黑逍遙散按熟地黃∶柴胡∶當歸∶白芍∶茯苓∶白術∶生姜∶甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1比例，購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，采取傳統水煎法制備成水煎液，無菌條件裝瓶，4 ℃貯存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號1604043。

1.3? 主要試劑與儀器

Fluo-3/AM（翊圣，F58890），PluronicF-127（上海復凝科技有限公司），無鈣和含鈣人工腦脊液（自配），胰蛋白酶（翊圣，T1826471），Rabbit Anti- Calmodulin Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-CaMKⅡα Polyclonal Antibody（北京博奧森生物技術有限公司，bs-0527R、bs-3666R），辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（中杉金橋，ZB-2301），TRIzolTM Reagent （Invitrogen Corporation， Cat. No.15596026），GoScriptTM Reverse Transcription System和GoTaq?qPCR Master Mix（Promega Corporation，0000303542、0000275172）。1 mL和10 ?L微量加樣器（Eppendorf，R18012G、H18771H），激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus，RS2000TM），連續(xù)波長酶標儀（美國Bio-Rad），PCR儀（美國Bio-Rad，CFX96），超薄切片機（瑞典LKB），電腦生物組織攤烤片機（浙江金華），光學顯微鏡（日本Olympus，CKX21）。

2? 實驗方法

2.1? 分組及給藥

將30只4月齡AD小鼠按隨機分組法分為3組，給藥劑量按人和動物體表面積比進行換算。黑逍遙散組給予黑逍遙散水煎液（6 g原藥材/kg）灌胃，陽性對照組給予鹽酸多奈哌齊（3.25 mg/kg）藥液灌胃，給藥體積0.2 mL/10 g。同月齡同系種小鼠10只作為空白組，模型組和空白組給予等體積純凈水灌胃。每日1次，連續(xù)3個月。

2.2? 熒光探針結合激光共聚焦顯微鏡技術檢測海馬神經元[Ca2+]i相對熒光強度

參照文獻[10-13]方法，主要步驟包括標本制作、神經細胞Fluo-3/AM負載、激光共聚焦顯微鏡技術檢測和圖象分析等。

2.3? 實時熒光定量PCR檢測

Trizol法提取小鼠海馬組織總RNA，檢測濃度純化后，反轉錄成cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。引物CaM、CaMKⅡα、GAPDH由寶生物工程（大連）有限公司合成，其序列詳見表1。按95 ℃預熱3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃ 退火與延伸40 s，40個循環(huán)，PCR儀進行擴增反應。2-ΔΔCt法分析結果，計算相對表達量。

2.4? 免疫組化檢測

切片經脫蠟、抗原修復、沖洗、內源性過氧化物酶滅活處理后，加一抗Rabbit Anti-Calmodulin Polyclonal Antibody（1∶400）、Rabbit Anti-CaMKⅡα Polyclonal Antibody（1∶200）將載玻片置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，PBS沖洗2次×5 min，滴加二抗（1∶500），室溫孵育30 min，取出后PBS沖洗2次×5 min，滴加顯色劑，經復染、脫水和透明后，樹膠封片，拍照。

3? 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD法，不齊用Dunnetts T3。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 黑逍遙散對模型小鼠海馬神經元[Ca2+]i相對熒光強度的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬神經元[Ca2+]i相對熒光強度顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬神經元[Ca2+]i相對熒光強度顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與陽性對照組比較，黑逍遙散組小鼠海馬神經元[Ca2+]i相對熒光強度略高，但差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖1、表2。

4.2? 黑逍遙散對模型小鼠海馬組織鈣調蛋白、鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱα mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬組織CaM mRNA相對表達量顯著升高，CaMKⅡα mRNA相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬組織CaM mRNA相對表達量顯著降低，CaMKⅡα mRNA相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與陽性對照組比較，黑逍遙散組小鼠海馬組織CaM mRNA相對表達量有所升高，CaMKⅡα mRNA相對表達量有所降低，但差異均無統計學意義（P>0.05）。結果見表3。

4.3? 黑逍遙散對模型小鼠海馬組織鈣調蛋白、鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱα蛋白表達的影響

CaM、CaMKⅡα陽性表達多出現在神經元胞漿或核位置，呈黃色或棕黃色顆粒。與空白組比較，模型組小鼠海馬組織CaM蛋白陽性表達顯著增強，CaMKⅡα蛋白陽性表達顯著減弱（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬組織CaM蛋白陽性表達顯著減弱，CaMKⅡα蛋白陽性表達顯著增強（P<0.05，P<0.01）;與陽性對照組比較，黑逍遙散組CaM蛋白陽性表達相對增強，CaMKⅡα蛋白陽性表達相對減弱，但差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表4、圖2和圖3。

5? 討論

AD屬中醫(yī)學“呆證”“健忘”等范疇，其病位在腦，但與肝、腎等臟腑功能紊亂尤為密切。黑逍遙散出自《醫(yī)宗己任編》，具有肝脾腎并調、氣血精兼顧功效，通過清利腦絡充養(yǎng)神竅能有效緩解AD患者行為異常[14]，對AD模型具有調節(jié)中樞單胺類神經遞質、抗氧化應激、保護神經元等防治效果[15-17]。AD發(fā)病機制十分復雜，中醫(yī)復方具有多組分、多靶點治病特點，因此，基于中醫(yī)學理論結合現代醫(yī)學研究成果從信號轉導通路著手，尋找有效的AD防治策略。

鈣穩(wěn)態(tài)失衡可導致AD發(fā)生的病理模式逐漸得到醫(yī)學界認可并成為研究焦點[5，18-20]。前期研究表明，黑逍遙散防治AD可能與Ca2+-CaM/CaMKⅡα信號通路有關[9]。鈣信號的形成與維持參與了學習和記憶機制，長時程增強作用（long term potentiation，LTP）是學習和記憶形成與維持的微觀模式，而神經細胞游離Ca2+濃度是影響LTP形成的重要因素之一，其主要參與神經信號的傳遞和神經遞質的釋放[21]。CaM首先發(fā)現于細胞漿，但也存在于細胞核中，在哺乳動物中樞神經系統中非常豐富。在細胞信號轉導過程中，CaM是Ca2+的受體蛋白，Ca2+所介導的信號轉導大多數以Ca2+-CaM復合物的方式激活靶酶，活化的CaM經Ca2+-CaM依賴性蛋白激酶途徑，具有調節(jié)神經遞質的合成與釋放、調節(jié)離子通道活性、細胞轉運、神經軸突延伸、突觸可塑性、學習記憶及基因表達等多種生理功能，影響細胞的生長和分裂[22]。

CaMKⅡα是一種主要表達于皮質、海馬、杏仁核和基底神經節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可經假底物區(qū)的自動磷酸化進行調節(jié)。CaM缺乏時，假底物區(qū)和CaM結合掩蔽了催化域，阻止底物與ATP結合而使激酶處于自身抑制狀態(tài);當細胞內Ca2+濃度升高，促使Ca2+-CaM與激酶的CaM結合區(qū)相互作用引起構象改變，自身抑制區(qū)失活，激活CaMKⅡ與Mg2+/ATP結合而起催化作用[23]。CaMKⅡα是Ca2+的重要靶酶，在腦組織含量最高，通過磷酸化許多底物蛋白來傳導Ca2+信號，神經元的可塑性、神經遞質的合成和釋放、LTP和細胞骨架修飾等都起著重要作用，可定位于神經元胞漿、軸突、樹突及突觸的前后膜[24]。CaMKⅡ可引起CREB磷酸化，從而調節(jié)海馬區(qū)基因轉錄，通過下游基因的表達加強海馬區(qū)LTP的形成[25]。

APP/PS雙轉基因小鼠模型已廣泛用于實驗研究，該模型小鼠優(yōu)勢在于將APPswe和PS1dE9這2個易感基因結合在一起，彌補了單一突變基因所引起的病理改變相對單一、病理變化時間相對較長的缺陷。有研究表明，該模型小鼠3月齡時在其大腦內未檢測到明顯老年斑，但已存在記憶缺陷的表現，而到4～5月齡時其大腦皮層開始出現老年斑[26]。上述研究結果表明，這種小鼠模型模擬了人類早發(fā)型AD的部分疾病特征，可用于預防或治療AD的藥理實驗研究。雖然該模型能模擬人類AD患者年齡依賴性老年斑的形成、膠質細胞增生和突觸減少等部分神經病理特征，并表現出與AD臨床相似的行為學障礙，也有助于AD的病因、發(fā)病機制及治療策略等相關研究，但其未見神經纖維纏結這一AD特征性病理改變，故在應用過程中仍具有一定的局限性[27]。

前期研究顯示，未治療的7月齡AD模型小鼠已經出現明顯行為學異常，而經黑逍遙散干預后小鼠學習和記憶能力顯著提升[28]。本研究結果表明，黑逍遙散能明顯降低AD模型小鼠海馬神經元Ca2+濃度，下調海馬區(qū)CaM基因和蛋白表達，上調CaMKⅡα基因和蛋白表達，因此推斷黑逍遙散可能是通過調節(jié)Ca2+-CaM/CaMKⅡα通路關鍵因子的表達而發(fā)揮防治AD作用的，具體機制還需今后深入研究。

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（收稿日期：2019-04-22）

（修回日期：2019-05-14;編輯：華強）