聚苯乙烯納米塑料暴露對小鼠腸道免疫的影響

賈田江，陳怡，張俊波，李奡，黃沛力,*

1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069

2.環(huán)境毒理學(xué)北京市重點實驗室，北京 100069

3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心醫(yī)學(xué)機能學(xué)教學(xué)實驗室，北京 100069

納米塑料(nanoplastics,NPs)是指尺寸<1 μm的塑料碎片或顆粒[1]，根據(jù)其來源NPs可分為由人工合成的添加于個人護理用品中或用于載藥、生物成像、生物傳感等領(lǐng)域的初級NPs[2]，以及塑料制品在自然環(huán)境中經(jīng)風(fēng)化降解而形成的次級NPs。盡管受到檢測手段的限制，環(huán)境與食品中NPs的含量尚不清楚，但Lambert和Wagner[3]在實驗室觀測到了一次性咖啡杯蓋可以降解成NPs，Hernandez等[4]則在塑料茶包中檢測到了約31億個NPs，上述研究均證實了人類接觸NPs的機會和風(fēng)險正在增加，因此，探究NPs的潛在毒性效應(yīng)具有重要意義。

目前對于NPs的毒性研究多集中于細胞和水生模式生物[5-8]，現(xiàn)有研究表明，消化道是生物體暴露于NPs的主要途徑，攝入體內(nèi)的NPs會在腸道蓄積并穿過腸道組織進入循環(huán)系統(tǒng)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫損傷和脂質(zhì)代謝紊亂等不良影響[9-10]。然而，對于與人類生理機能接近的哺乳動物的毒性研究，迄今鮮有報道?；诖?，本研究以小鼠為受試對象，觀察了聚苯乙烯納米塑料(PS NPs)連續(xù)經(jīng)口暴露對小鼠腸道免疫的影響，以期為NPs的潛在毒性效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險評估提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物與試劑

SPF級雌性BALB/c小鼠40只，6周齡，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010，小鼠飼養(yǎng)及相關(guān)實驗操作均符合首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的相關(guān)要求(倫理審查號：2018-0003)。飼養(yǎng)溫度為20～26 ℃，濕度為40%～70%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h，期間正常通風(fēng)換氣，小鼠自由飲水、攝食。染毒前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

PS NPs(100 nm)懸液購自中科雷鳴(北京)科技有限公司，濃度為50 mg?mL-1，使用Milli-Q超純水將純化后的PS NPs配成濃度分別為0.05、0.5和5 mg?mL-1的懸液，超聲振蕩30 min后制成PS NPs染毒懸液，備用；生理鹽水購自石家莊四藥有限公司；多聚甲醛固定液(4% PFA)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

透射電子顯微鏡(JEM-2100，JEOL，日本)；馬爾文激光粒度(ZS90，Malvern，英國)；超純水機(Millipore，Milli-Q，法國)；超聲波清洗器(KQ3200E型，江蘇昆山市淀山儀器，中國)；低溫高速離心機(Eppendorf，5424R，德國)；全自動生化儀(AU480，貝克曼，美國)；石蠟切片機(RM2235，Leica，德國)；全自動切片掃描儀(Pannoramic scan，3DHistech，匈牙利)。

1.3 PS NPs的表征

將PS NPs用Milli-Q超純水稀釋至50 μg?mL-1，超聲振蕩30 min，移取10 μL滴于碳支持膜上使其分散均勻，置于干燥器中待完全干燥后，使用透射電子顯微鏡觀察PS NPs的粒徑和形態(tài)；移取1 mL于粒徑樣品池和電位樣品池中，使用馬爾文激光粒度儀檢測PS NPs的粒徑分布和Zeta電位。

1.4 小鼠染毒與處理

適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后將小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。對照組小鼠每天灌胃純水，染毒組劑量參考此前以微塑料染毒小鼠的劑量[11-13]，3個染毒組分別按0.5、5和50 mg·kg-1灌胃PS NPs懸液，連續(xù)灌胃7 d。整個染毒期間觀察小鼠的飲水、攝食、外觀和活動狀況，并做詳細記錄；在染毒的第1、3、5和7天記錄小鼠體質(zhì)量，并繪制連續(xù)染毒7 d小鼠的體質(zhì)量變化趨勢圖。分別于染毒3 d后和7 d后將小鼠摘眼球取血并保存于EDTA抗凝管中，3 000 r·min-1離心10 min分離血漿，使用全自動生化儀通過免疫比濁法檢測補體C3(C3)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量，通過雙縮脲法和溴甲酚綠法分別檢測總蛋白和白蛋白的含量，并計算白球比(A/G)。染毒7 d后經(jīng)麻醉取小腸和結(jié)腸各1～2 cm，生理鹽水沖洗凈腸道內(nèi)容物，分別置于4%的多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)組織脫水、包埋、切片后，小腸進行HE染色，觀察小腸的組織形態(tài)；結(jié)腸進行AB-PAS染色，Image J軟件計算分析結(jié)腸的黏液分泌情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示，各組間的顯著性差異檢驗采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PS NPs的表征

PS NPs的透射電子顯微鏡圖像如圖1所示，顯示PS NPs尺寸均一，且分散性良好。馬爾文激光粒度儀的結(jié)果顯示PS NPs水合粒徑為(157.07±0.71) nm (多分散性指數(shù)=0.02±0.03)，Zeta電位為(-23.73±0.15) mV，說明PS NPs粒徑分布均勻，且在超純水中穩(wěn)定性良好。

圖1 聚苯乙烯納米塑料(PS NPs)的透射電子顯微鏡圖Fig. 1 The transmission electron microscope image of polystyrene nanoplastics (PS NPs)

2.2 小鼠一般狀況

PS NPs染毒期間各組小鼠全部存活。各劑量組小鼠的飲食和活動未見異常，毛色外觀和糞便與對照組相比基本無差異。染毒期間不同劑量PS NPs對小鼠體質(zhì)量的增量變化影響如圖2所示。對照組(圖2(a))和低劑量組(圖2(b))小鼠在染毒期間體質(zhì)量逐漸增加，而中劑量組(圖2(c))和高劑量組(圖2(d))小鼠體質(zhì)量增長緩慢，甚至呈停滯或下降趨勢。

圖2 PS NPs暴露對小鼠體質(zhì)量變化趨勢的影響注：(a) 對照組；(b) 0.5 mg·kg-1；(c) 5 mg·kg-1；(d) 50 mg·kg-1。Fig.2 The effects of PS NPs exposure on the weight change trends in miceNote:(a) Control group;(b) 0.5 mg·kg-1;(c) 5 mg·kg-1;(d) 50 mg·kg-1.

2.3 小鼠免疫相關(guān)血生化指標

經(jīng)PS NPs連續(xù)染毒后小鼠免疫相關(guān)血生化指標情況如圖3所示。連續(xù)染毒3 d后，與對照組相比，隨著染毒劑量的增加，C3含量逐漸下降(高劑量組，P<0.05)；A/G變化不明顯；IgG含量在中劑量組時達到峰值，而后隨著染毒劑量的增加而降低；IgM含量呈逐漸下降的趨勢。連續(xù)染毒7 d后，中劑量組和高劑量組小鼠的C3含量有所恢復(fù)；A/G變化不明顯；IgG含量在中劑量組時最高；IgM含量在低劑量組時低于其余各組的含量且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 PS NPs暴露對小鼠免疫相關(guān)血生化指標的影響注：(a)～(d)連續(xù)暴露3 d后，(e)～(h)連續(xù)暴露7 d后；A/G表示白球比，IgG表示免疫球蛋白G，IgM表示免疫球蛋白M；*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.3 The effects of PS NPs exposure on immune-related blood biochemical indices in miceNote:(a)～(d) Continuous exposure for 3 d,and (e)～(h) Continuous exposure for 7 d;A/G represents globulin ratio,IgG represents immunoglobulin G,and IgM represents immunoglobulin M;*represents P<0.05,and **represents P<0.01.

2.4 小鼠小腸組織形態(tài)觀察

小鼠經(jīng)剖檢，各組別小鼠各腸段均無肉眼可見的異常。HE染色結(jié)果如圖4所示，對照組小鼠小腸可見黏膜、黏膜下層、肌層和外膜4層結(jié)構(gòu)，黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，小腸絨毛呈舌狀且排列規(guī)則、密集，紋狀緣清晰，上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，杯狀細胞分布均勻，隱窩形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰；低劑量組小鼠小腸結(jié)構(gòu)基本正常；中劑量組和高劑量組小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)小腸絨毛排列紊亂、松散，絨毛變短、腫脹、斷裂破損，紋狀緣不清晰，上皮細胞間質(zhì)正常結(jié)構(gòu)消失呈自溶性改變，黏膜固有層增寬，隱窩變淺，且高劑量組小鼠小腸結(jié)構(gòu)損傷程度加重。

圖4 PS NPs暴露對小鼠小腸結(jié)構(gòu)的影響(HE)注：(a),(e) 對照組；(b),(f) 0.5 mg·kg-1；(c),(g) 5 mg·kg-1；(d),(h) 50 mg·kg-1。Fig.4 The effects of PS NPs exposure on small intestinal structure in mice (HE)Note:(a),(e) Control group;(b),(f) 0.5 mg·kg-1;(c),(g) 5 mg·kg-1;(d),(h) 50 mg·kg-1.

2.5 小鼠結(jié)腸黏液分泌觀察

PS NPs連續(xù)暴露7 d后小鼠結(jié)腸黏液的分泌情況如圖5所示。與對照組相比，隨著染毒劑量的增加，結(jié)腸分泌的黏液逐漸減少(中劑量組，P<0.05；高劑量組，P<0.0001)。高劑量組結(jié)腸分泌的黏液低于中劑量組(P<0.01)、低劑量組(P<0.001)和對照組(P<0.0001)。

圖5 PS NPs暴露對小鼠結(jié)腸黏液分泌的影響(AB-PAS,200×)注：(a) 對照組；(b) 0.5 mg·kg-1；(c) 5 mg·kg-1；(d) 50 mg·kg-1；(e)黏液分泌面積與結(jié)腸面積之比；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。Fig.5 The effects of PS NPs exposure on colonic mucus secretion in mice (AB-PAS,200×)Note:(a) Control group;(b) 0.5 mg·kg-1;(c) 5 mg·kg-1;(d) 50 mg·kg-1;(e) the ratio of the mucus secretion area to the entire colon area; *represents P<0.05,**represents P<0.01,***represents P<0.001,and ****represents P<0.0001.

3 討論(Discussion)

塑料是重要的有機合成高分子材料。目前全球塑料的年產(chǎn)量約3億t[14]，并仍在呈指數(shù)增長趨勢不斷增加。塑料的大規(guī)模生產(chǎn)和使用造成大量塑料廢棄物的堆積。近年來，全球面臨的塑料垃圾污染日益嚴重。據(jù)估計，全球每年有超過800萬t塑料垃圾進入海洋，并隨水力、風(fēng)力擴散至各處。PS是應(yīng)用最廣泛的塑料之一，也是海洋垃圾中最豐富的塑料之一[15]。塑料具有持久性，難以回收、降解的塑料垃圾可在環(huán)境中存在數(shù)百年甚至數(shù)千年，在此期間經(jīng)機械磨損、紫外線輻射和微生物降解等作用被分解形成微塑料(MPs)[16]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，MPs會進一步降解形成NPs[17]。據(jù)估計，直徑為5 mm的MPs球形顆粒完全破碎可以降解成1014個直徑為100 nm的NPs球形碎片[18]。研究證實顆粒物的尺寸是影響其毒性的重要因素之一[19]，大多數(shù)情況下顆粒物的毒性會隨顆粒尺寸的減小而增大，由于NPs的納米尺寸，很容易被攝取而后跨越各種生物屏障，作用于組織和細胞產(chǎn)生細胞和分子層面上的毒性效應(yīng)[20]，并且排出較為緩慢，由此可能會導(dǎo)致更強的生物毒性和生物積累效應(yīng)。因此，NPs的潛在毒性效應(yīng)亟待進一步探究。

NPs對免疫功能的影響是評估其潛在風(fēng)險的重要項目之一。腸道是機體最大的免疫器官，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[18]。腸道黏膜上皮是腸道的機械屏障，緊密連接的腸道黏膜上皮結(jié)構(gòu)可以有效阻止有害物質(zhì)穿透；由杯狀細胞分泌的黏液是腸道化學(xué)屏障的重要構(gòu)成之一，具有調(diào)節(jié)免疫、保護腸壁黏膜細胞和維持黏膜穩(wěn)態(tài)的作用[21-23]。小腸是機體對營養(yǎng)物質(zhì)進行消化、吸收的主要部位。因此，腸道結(jié)構(gòu)的完整性是維持正常腸道免疫屏障功能的重要因素，也是機體生長發(fā)育的重要保障。研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道是NPs攝入后的主要富集部位[9,24]。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)粒徑為70 nm的NPs經(jīng)金魚幼苗的口咽腔攝入并在消化道蓄積，并抑制其體長增長，且導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)受損，腸腔變大，腸壁外膜與肌層分離，黏膜下層結(jié)構(gòu)疏松，腸黏膜層結(jié)構(gòu)破壞。

為模擬現(xiàn)實中生物體對于NPs的攝入途徑，本研究采用灌胃的方式探究了PS NPs對小鼠腸道免疫的影響及其劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，NPs暴露導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量增長緩慢甚至停滯，小腸絨毛變短、破損、紊亂，結(jié)腸黏液分泌減少，且具有劑量依賴效應(yīng)，說明PS NPs暴露會破壞腸道免疫屏障功能，破壞絨毛完整性從而降低腸道的消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力，這與現(xiàn)有的文獻報道結(jié)果一致[9,25]。此外，由于腸道的損傷可能會影響?zhàn)つっ庖呒毎陌l(fā)育以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，進而導(dǎo)致免疫球蛋白的含量改變，因此本研究檢測了PS NPs暴露對小鼠免疫相關(guān)血生化指標的時間-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示，PS NPs暴露導(dǎo)致小鼠血漿中C3含量下降，IgG呈增高趨勢，IgM呈下降趨勢隨后有所恢復(fù)，說明PS NPs暴露可導(dǎo)致補體系統(tǒng)活化并引起機體免疫功能受損。綜上所述，PS NPs攝入可損傷小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)，影響其生長發(fā)育，通過干擾腸道免疫屏障穩(wěn)態(tài)，引起免疫功能紊亂。關(guān)于NPs免疫毒性機制的深入研究仍需要進一步探討。