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    TLR4對母-胎界面滋養(yǎng)層細胞生物學(xué)行為的影響

    2019-11-15 01:52:48楊美霞黃世琪
    中國計劃生育學(xué)雜志 2019年7期
    關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層蛻膜共培養(yǎng)

    宋 芳 楊美霞 賀 帥 黃世琪 郝 奮

    包頭醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究所(014040)

    Toll樣受體4(TLR4)屬于I型跨膜蛋白,是天然免疫系統(tǒng)中的一類重要模式識別受體,在調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)中起重要作用,可能參與自然流產(chǎn)的發(fā)生[1-3]。筆者前期研究亦發(fā)現(xiàn),早期自然流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞中TLR4表達均明顯高于正常妊娠婦女,說明母-胎界面TLR4異常表達是導(dǎo)致妊娠失敗的原因之一[4]。由此推測,在“著床窗”開放時,TLR4可能影響母-胎界面細胞生物學(xué)行為,但目前尚未見報道。因此,本實驗利用小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)著床模型[5],觀察TLR4對胚泡滋養(yǎng)層細胞在母體蛻膜細胞上粘附和鋪展的影響,揭示TLR4對胚胎著床的影響及作用環(huán)節(jié),為臨床治療不孕癥提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 組織來源

    ①蛻膜組織:來源于包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科妊娠5~6周的人工流產(chǎn)婦女,平均年齡30歲,月經(jīng)周期正常,3個月內(nèi)未用任何激素類藥物。②實驗動物:選用成年昆明種遠交系小鼠(中國科學(xué)院動物研究所,7~9周齡,25~35g),動情期雌鼠與雄鼠2∶1合籠,次日晨發(fā)現(xiàn)陰栓者為妊娠1d,于妊娠4d用頸椎脫臼法處死雌鼠,迅速剪開腹腔,在解剖鏡下用PBS緩沖液沖洗雙側(cè)子宮角,收集胚泡,按照參考文獻[6]的方法制備胚泡石蠟切片;同時將子宮用Bouin液固定,常規(guī)石蠟包埋制備組織切片。

    1.2 主要試劑

    小鼠抗人TLR4單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品,SP試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,DAB顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。胎牛血清(FCS)和小牛血清白蛋白(BSA)為Hyclone公司產(chǎn)品。

    1.3 免疫組織化學(xué)染色(SP法)

    切片常規(guī)脫蠟水化,滴加過氧化物酶阻斷溶液(試劑A),室溫孵育30min;滴加正常非免疫動物血清(試劑B)封閉30min;滴加小鼠抗人TLR4抗體(1:200), 4℃過夜;滴加生物素標記的第二抗體(試劑C),室溫孵育15min;滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D),室溫孵育15min。DAB-H2O2室溫顯色,Mayer蘇木精復(fù)染細胞核,脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗,其余步驟同上。

    1.4 人子宮蛻膜細胞的分離、純化與鑒定

    取人工流產(chǎn)蛻膜組織,按照參考文獻[4]的方法分離純化蛻膜細胞,以5×105個/ml密度接種于50ml細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),細胞爬片用小鼠抗人波形蛋白抗體(1:100)檢測純度。

    1.5 小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)

    將消化重懸的蛻膜細胞以1×106個/ml密度加入到含15%FCS-199的培養(yǎng)皿中,待細胞增殖生長成層后,換用0.4%BSA-199培養(yǎng),每皿中移入5~10個胚泡,在倒置顯微鏡下觀察胚泡的粘附和鋪展情況。取共培養(yǎng)72h細胞爬片,制備掃描電鏡標本,觀察小鼠滋養(yǎng)層細胞與人蛻膜細胞生長情況。

    1.6 胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附與鋪展

    待細胞生長匯合成層后,實驗組分別換用經(jīng)0.4%BSA-199稀釋的不同濃度(100、200、400ng/ml)抗TLR4抗體,對照組用無抗體的0.4%BSA-199進行培養(yǎng)。每皿移入15~20個胚泡,分別于培養(yǎng)24h、48、72h時在倒置顯微鏡下觀察并記錄胚泡的粘附和鋪展情況。快速輕晃培養(yǎng)皿,胚泡不移動者為粘附;已粘附的胚泡滋養(yǎng)層細胞外延生長≥80μm者為鋪展。分別于共培養(yǎng)24、48h統(tǒng)計粘附率和鋪展率,于共培養(yǎng)72h用顯微鏡目測柵測量并計算鋪展面積。相同實驗至少重復(fù)3次,每組觀察35~40個胚泡。

    1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 著床前小鼠胚泡和子宮內(nèi)膜中TLR4蛋白表達

    TLR4蛋白在小鼠胚泡的內(nèi)細胞群和滋養(yǎng)層細胞的胞質(zhì)內(nèi)均有陽性表達,呈棕黃色(圖1A、B、C)。TLR4在妊娠4d小鼠子宮內(nèi)膜的蛋白表達主要定位在腔上皮細胞的游離面,深棕色陽性信號較強,腺上皮細胞和基質(zhì)細胞表達較弱(圖1D)。

    A:早期胚泡 B:中期胚泡 C:晚期胚泡 D:妊娠4d子宮內(nèi)膜 圖1 TLR4蛋白在妊娠4d小鼠胚泡和子宮內(nèi)膜的表達(×200)

    2.2 蛻膜細胞的純化和共培養(yǎng)著床模型的建立

    蛻膜細胞培養(yǎng)18h即已貼壁,細胞呈圓形,24h后個別細胞開始伸出突起,呈成纖維細胞樣(圖2A),培養(yǎng)9d后已全部匯合成層(圖2B)。傳代后,第三代蛻膜細胞用小鼠抗人波形蛋白抗體檢測蛻膜細胞純度,胞漿內(nèi)有棕黃色陽性顆粒、細胞核不著色者為蛻膜細胞,其純度均>95%(圖2C)。

    小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)72h,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)小鼠滋養(yǎng)層細胞的突起與人蛻膜細胞的突起相互接觸(圖3A),并且可見滋養(yǎng)層細胞的突起伸入到蛻膜細胞下面(圖3B),說明體外共培養(yǎng)著床模型建立成功。

    A:培養(yǎng)24h人蛻膜細胞,個別已貼壁(×150) B:培養(yǎng)第9天人蛻膜細胞,已匯合成層(×150) C:波形蛋白免疫組織化學(xué)染色顯示蛻膜細胞(×200)圖2 體外培養(yǎng)人蛻膜細胞

    A:小鼠滋養(yǎng)層細胞(T)與人蛻膜細胞(D)相互接觸 B:小鼠滋養(yǎng)層細胞(T)伸入人蛻膜細胞(D)下面圖3 共培養(yǎng)72h掃描電鏡觀察

    2.3 抗TLR4抗體對胚泡滋養(yǎng)層細胞粘附和鋪展的影響

    2.3.1對照組大多數(shù)胚泡于共培養(yǎng)12h脫去透明帶,共培養(yǎng)24h,孵出的胚泡粘附到蛻膜細胞上,其粘附率為90.32%,未粘附的則懸浮在培養(yǎng)液中,而且不能進一步生長(圖4A);共培養(yǎng)48h,已粘附的胚泡滋養(yǎng)層細胞外延生長,鋪展率為83.87%;共培養(yǎng)72h滋養(yǎng)層細胞明顯向外擴展,平均擴展面積為(194.00×103) μm2(圖4B)。

    A:共培養(yǎng)24h,胚泡粘附到蛻膜細胞上 B:共培養(yǎng)48h,胚泡滋養(yǎng)層細胞外延生長 圖4 對照組小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)(×150)

    2.3.2實驗組胚泡能正常孵出、粘附,但其滋養(yǎng)層細胞的外延生長明顯受到抑制,各濃度組共培養(yǎng)72h的鋪展情況如圖5所示。3個不同濃度抗體組的粘附率分別與對照組相比無差異(P>0.05),鋪展率100ng/ml組、200ng/ml組、400ng/ml組分別與對照組相比有差異(P<0.01)。共培養(yǎng)72h抗體組滋養(yǎng)層細胞的擴展面積以劑量依賴的方式受到抑制,均低于對照組(P<0.01)。見表1。

    A:對照組,胚泡滋養(yǎng)層細胞明顯向外擴展 B:100ng/ml組,滋養(yǎng)層細胞外延生長,但擴展面積明顯減小 C:200ng/ml組,擴展面積較對照組明顯減小 D:400ng/ml組,局部滋養(yǎng)層細胞向外生長,擴展面積明顯減小 圖5 各組小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng)72h(×150)

    組別 粘附率(%) 鋪展率(%) 擴展面積(×103μm2) 對照組 87.4±2.383.5±3.3194.1±8.2100ng/ml組78.5±2.5 64.3±4.0*63.49±5.0**200ng/ml組 82.3±2.651.3±4.1**60.2±5.2**400ng/ml組 77.3±3.046.2±4.2**58.5±4.86**

    *與對照組相比P<0.05**與對照組相比P<0.01

    3 討論

    正常妊娠可以看作是一種成功的同種半異體移植,母胎間存在著復(fù)雜的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)機制,母體的免疫功能處于一定的耐受狀態(tài),是胚泡著床和維持妊娠的關(guān)鍵。胚泡著床是個復(fù)雜的生理過程。有研究證實,TLR4在胎盤滋養(yǎng)層細胞上有表達,其激活可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,有利于機體抵抗病原微生物感染或組織損傷,但是過強的免疫反應(yīng)也會帶來不利影響[7]。代盈盈等[8]研究發(fā)現(xiàn),TLR4在妊娠期關(guān)中奶山羊子宮的分布和表達具有一定的規(guī)律,并可能參與子宮的免疫和分泌調(diào)節(jié)功能。

    由于體內(nèi)研究無法人為地控制胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附和進一步的發(fā)育,難以準確地觀察胚泡著床各階段的變化以及各種相關(guān)因素間的協(xié)調(diào)作用。筆者參考Yoshimura等[5]建立的小鼠胚泡和人蛻膜細胞共培養(yǎng)的體外著床模型,與其不同的是,采用復(fù)合酶直接消化法,省去了Percoll密度梯度離心的復(fù)雜過程。根據(jù)早期胚胎對蛻膜組織無種屬要求的特點,用妊娠4d小鼠胚泡與人蛻膜細胞共培養(yǎng),72h時掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)小鼠滋養(yǎng)層細胞的突起與人蛻膜細胞的突起相互接觸,并且可見滋養(yǎng)層細胞的突起伸入到蛻膜細胞下面,證明建立的體外共培養(yǎng)著床模型是成功的,而且用于研究胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附和鋪展情況可行。

    為了研究TLR4在小鼠胚泡著床過程中的具體作用環(huán)節(jié),在匯合成層的人蛻膜細胞中分別加入不同濃度抗TLR4抗體,與小鼠胚泡共培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察并統(tǒng)計粘附率、鋪展率及擴展面積。通過預(yù)實驗在TLR4缺少的耐受范圍內(nèi)選擇100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml 3個不同濃度。從實驗結(jié)果看,抗TLR4抗體不影響胚泡的粘附,但明顯抑制其鋪展,并且這種抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。由此可見,在滋養(yǎng)層細胞粘附、遷移、分化過程中,可能是由于TLR4介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號啟動時間不同,其調(diào)節(jié)著床的機理可能是通過激活NF-kB進而影響細胞的行為,如粘附、增殖、分化等[9-10]。TLR4能識別并快速啟動天然免疫反應(yīng),釋放出各種炎癥因子,激活各種免疫細胞抵抗微生物入侵,以維持正常妊娠,這與筆者的前期研究是一致的,即著床前隨著卵巢類固醇激素分泌增加,子宮內(nèi)膜IL-8的表達逐漸增強,為子宮內(nèi)膜處于接受狀態(tài)以更好地完成與胚胎之間的識別、粘附做準備,IL-8可趨化更多的中性粒細胞移入基質(zhì),分泌彈性蛋白酶,降解III型膠原蛋白,利于胚泡侵入子宮內(nèi)膜[11]。由此可見,在胚胎著床過程中,可能是通過TLR4 -NF-κB通路激發(fā)炎癥因子,如TNF-α、IL-2、IL-8等多種的炎性因子的釋放,使胚泡滋養(yǎng)層細胞的侵入性和子宮內(nèi)膜的接受性同步,保證著床順利進行。

    研究結(jié)果表明:TLR4在著床前胚泡的內(nèi)細胞群和滋養(yǎng)層細胞均有表達,且不影響胚泡滋養(yǎng)層細胞的粘附,但對鋪展有促進作用,說明TLR4參與小鼠胚泡著床,且作用環(huán)節(jié)不同,胚泡粘附、鋪展以及滋養(yǎng)層細胞的進一步生長是由不同機制所介導(dǎo)。

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