葡萄致腐菌的分離及大蒜汁對其抑制效果研究

張薇，羅吉慶，江麗慧，張永杰，陳瑩琪

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000)

葡萄皮薄，果實含糖高，在貯運過程中易破損成為一些致腐菌的天然培養(yǎng)基，因此葡萄采后腐爛是葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要障礙。葡萄果實采后病害防治主要采用SO2熏蒸、低溫冷藏和氣調(diào)貯藏的方法[1，2]，但其技術(shù)要求和操作成本均較高，且大量使用化學(xué)殺菌劑會使致病菌產(chǎn)生抗藥性,對人體健康及環(huán)境也會造成危害。因此，開發(fā)一種安全、有效的天然殺菌劑用于葡萄采后病害防治具有巨大應(yīng)用前景。

天然植物殺菌劑具有低毒、環(huán)境友好等特點[3-5]。大蒜對多種病原微生物及腫瘤都有不同程度的抑制或殺滅作用[6-8]。對大蒜汁液的直接應(yīng)用研究較少且集中于對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等細(xì)菌[9-12]的抑制效果研究，關(guān)于大蒜汁對葡萄采后病害的防治研究鮮有報道[13,14]。本文結(jié)合葡萄貯藏防腐和大蒜汁推廣應(yīng)用的實際情況，對新鮮大蒜汁和放置12 d的陳大蒜汁在不同濃度下對葡萄主要致腐真菌的抑制效果進行了研究[15]。使大蒜汁在葡萄防腐的推廣應(yīng)用中有了更大的優(yōu)勢，對大蒜的進一步開發(fā)利用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

白皮大蒜、巨峰葡萄、馬奶葡萄、馬鈴薯。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)、改良PDA培養(yǎng)基(加20%葡萄汁)：自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 感病、健康組織病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

采用組織塊分離法對感病組織病原菌進行分離，選取不同腐爛病狀的果實或果梗，用75%的消毒酒精進行表面消毒，在病健交界處切取植物組織1 cm2植入改良的PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d,至菌落直徑為1 cm時，挑取菌落邊緣少量菌絲植入另一PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)上述操作3～5次即可作為純化菌種備用，進行3批分離。

采用平板涂布法對健康組織病原菌進行分離，選取10個健康果?；蚬７湃?5%的消毒酒精中浸泡30 s，吸除酒精后，移入1%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，再用滅菌水清洗3次(本操作在滅過菌的培養(yǎng)皿中進行)，最后用滅菌紙吸干，放入研缽中研磨，果梗部位研磨時加入少量無菌水，最后在改良的PDA培養(yǎng)基上涂平板，果粒和果梗分別涂3個平板，進行3批分離。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，出現(xiàn)單個針尖大小的小菌落時迅速植入另一PDA培養(yǎng)基中進行純化。純化2～3次以后即可得到純菌種，備用。

將分離的致腐菌株回接到被分離的寄主果實或果梗上以后，若發(fā)病癥狀與貯運中腐敗癥狀相符，就可作為采后病害病原菌進一步鑒定到屬。根據(jù)各致腐菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征，水浸片中分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特征，參照相關(guān)真菌鑒定手冊進行鑒定[16]。

1.2.2 孢子懸液的制備

把得到的致腐菌接種在改良PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7 d進行菌種活化。將活化后的菌種制成菌懸液,于調(diào)速多用振蕩器振蕩30 min,鏡檢計數(shù)，然后用無菌水稀釋若干倍，配成適宜濃度(控制濃度為105～106spore/mL)的孢子懸液,待用。

1.2.3 大蒜汁的制備

稱取去皮大蒜50 g，搗碎，在38 ℃下酶解20 min，采用1∶1 (g/mL)的料液比加入無菌水，再于離心機中3000 r/min離心20 min，取上清液作為100%的大蒜汁，按二倍稀釋法用適量無菌水稀釋為50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%的大蒜稀釋液，混勻后備用。以當(dāng)日制備的新鮮大蒜汁為A組，28 ℃避光存放至第12天的大蒜汁作為陳大蒜，為B組。

1.2.4 致腐菌的體外熏蒸和直接接觸試驗

將定性濾紙剪成直徑為6 mm大小的圓形紙片，封裝于培養(yǎng)皿中，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

體外熏蒸試驗參考馮武的濾紙片法[17]。用無菌打孔器在培養(yǎng)7 d的致腐真菌平板上取直徑為 6 mm 的菌塊放入新制的PDA平板中央，將平板倒置。

直接接觸試驗參考鄧芳席等的抑制圈法[18]。將已滅菌冷卻至約50 ℃的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，待其凝固。編號后吸取待測致腐菌孢子懸液100 μL于培養(yǎng)基表面，涂布均勻，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中10 min使孢子附著在平板上。以上兩種試驗再用無菌鑷子夾取已經(jīng)滅過菌且在各稀釋度大蒜汁中浸泡過并瀝干的無菌圓形濾紙片貼在固體平板蓋中央，新鮮大蒜汁A組與陳大蒜汁B組各重復(fù)3次，以濾紙片上為無菌水的平板為對照，迅速用保鮮膜密封，于28 ℃培養(yǎng)2～5 d后觀察菌落生長情況。

體外熏蒸試驗用十字交叉法測量菌落生長直徑，由下式計算出抑制率：

抑制率(%)=(C-T)/C×100。

式中：C為對照菌落直徑(cm)；T為不同濃度條件下菌落直徑(cm)。

直接接觸試驗用十字交叉法測量抑菌圈直徑，抑菌效果的判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 抑菌效果的判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 最低抑制濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

將5 mL各稀釋度(由低到高)的大蒜汁和5 mL作為對照的無菌水分別加入到7個裝有15 mL已滅菌冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，混合均勻，待其凝固。編號后吸取待測致腐菌孢子懸液100 μL于培養(yǎng)基表面，涂布均勻，置于 28 ℃下培養(yǎng) 5 d，觀察有無菌落生長，若有記為陽性(+)，表明該稀釋度大蒜汁無抑制作用；若無記為陰性(-)，以完全沒有菌生長的最低濃度作為該大蒜汁的MIC。將完全沒有菌生長的平皿繼續(xù)培養(yǎng)4 d若仍不長菌，則為MBC，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 致腐菌的分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定

通過對2種葡萄的病原菌進行分離，一共得到6種真菌，但只有4種返接到葡萄上能致病。在顯微鏡下，對這些致病菌的形態(tài)學(xué)鑒定如下：

K-1 菌落表面菌絲初期為白色，成熟后為淺灰色，肉眼可見菌絲頂部的土灰色孢子囊，菌絲層較厚，基內(nèi)菌絲呈黑色，菌絲生長較慢，顯微鏡下可見其分生孢子梗頂端膨大，上生有小突起，分生孢子單生于小突起上，呈球形或亞球形，鑒定為灰霉菌見圖1。

圖1 葡萄致腐菌K-1的分生孢子(a)和分生孢子梗(b) 顯微鏡圖(×400)

K-2 菌落表面菌絲初期為白色，后轉(zhuǎn)為灰黑色，產(chǎn)生黑色顆粒狀孢囊，基內(nèi)菌絲呈黃色，可見有規(guī)則的放射狀，顯微鏡下可見其分生孢子頭頂囊呈球形或近球形，表面生兩層小梗，放射狀排列，成熟的分生孢子呈球形，鑒定為黑曲霉(見圖2)。

圖2 葡萄致腐菌K-2的分生孢子(a)和分生孢子梗(b) 顯微鏡圖(×400)

K-3 菌落表面呈青綠色粉末狀，有白色邊緣，基內(nèi)菌絲成熟后為黃色，生長速度較慢，顯微鏡下可見其分生孢子梗呈帚狀分枝，頂端產(chǎn)生許多瓶梗，瓶梗上著生有分生孢子鏈，分生孢子呈球形或卵圓形，鑒定為青霉屬菌(見圖3)。

圖3 葡萄致腐菌K-3的分生孢子(a)和分生孢子梗(b) 顯微鏡圖(×400)

K-4 菌落初期為白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，生長速度極快，1～2 d內(nèi)菌絲可迅速蔓延至整個平板，生長后期的氣生菌絲轉(zhuǎn)為淡褐色，菌絲層上部有黑色顆粒狀物出現(xiàn)，培養(yǎng)基背面呈褐色，顯微鏡下可見其直立孢囊梗下的假根，匍匐菌絲呈弓狀彎曲，孢子囊呈球形或橢圓形，孢子呈球形或橢圓形，鑒定為根霉屬(見圖4)。

圖4 葡萄致腐菌K-4的假根、孢子囊(a)和孢囊梗(b) 顯微鏡圖(×400)

2.2 致腐菌反接到葡萄上

本實驗中，主要分離葡萄致腐真菌，共分離得到6種真菌，其中4種返接馬奶葡萄果粒(見圖5)和巨峰葡萄果粒(見圖6)后，可引起并加速馬奶葡萄和巨峰葡萄果?；蚬８癄€，其余2種返接后均不引起腐敗。結(jié)果表明，在返接培養(yǎng)10 d后，與不接菌的對照相比，在馬奶葡萄上，灰霉比其他3種引起更加嚴(yán)重的癥狀(見圖5)。在返接培養(yǎng)10 d后，巨峰葡萄上對照也已開始腐爛，表明巨峰葡萄本身比馬奶葡萄更不耐保藏，且與對照相比，根霉引起癥狀更加明顯，青霉次之，然后是灰霉和黑曲霉(見圖6)。

圖5 馬奶葡萄的腐敗情況

圖6 巨峰葡萄的腐敗情況

2.3 4種致腐菌的體外熏蒸試驗和直接接觸試驗

按照1.2.1中的體外熏蒸試驗和直接接觸試驗方法進行操作，A組中不同濃度大蒜汁對灰霉、黑曲霉、青霉和根霉熏蒸后的抑制率和直接接觸后的抑菌效果見圖7、圖8和表2。

圖7 4種致腐菌的體外熏蒸試驗——A組

圖8 4種致腐菌的直接接觸試驗——A組

大蒜汁濃度(%)體外熏蒸抑制率(%)/直接接觸抑菌敏感度灰霉黑曲霉青霉根霉10031.1高55.6高38.4 高31.8高5019.3高52.6高30.1 高30.6高2517.8中43.0高23.9 中28.7中12.516.2中37.3高20.8 中28.3中6.2512.2中33.9中16.7 中21.7低3.138.3低27.9中10.5 低7.5低00.0不敏感0.0不敏感0.0 不敏感 0.0不敏感

由表2可知，A組的大蒜汁濃度越大，對4種致腐菌的抑菌效果越好，敏感度越高，100%和50%濃度的大蒜汁對4種致腐菌均為高度敏感抑菌效果；大蒜汁在相同濃度條件下，對黑曲霉的熏蒸抑制作用最強，25%和12.5%濃度的大蒜汁僅對黑曲霉有高度敏感抑菌效果，對青霉、灰霉和根霉均為中度敏感抑菌效果；3.13%濃度的大蒜汁對黑曲霉的抑制率高達(dá)27.9%，與25%濃度的大蒜汁對青霉和根霉的抑制率相差無幾，對黑曲霉為中度敏感抑菌效果，對青霉、灰霉和根霉均為低度敏感抑菌效果；6.25%濃度以上的大蒜汁對根霉的抑制效果差距較小，抑制率在25%左右，對根霉為低度敏感抑菌效果，對灰霉、黑曲霉和青霉均為中度敏感抑菌效果；12.5%濃度以下的大蒜汁對灰霉和青霉的熏蒸抑制作用大致相當(dāng)，12.5%濃度以上的大蒜汁對青霉的抑制作用較灰霉更強。由表2可知，黑曲霉的抑菌效果最強，灰霉最弱。

最頂端的對照為對照水對菌的作用，其他6個平板為相應(yīng)大蒜汁對菌的抑制效果。

B組中不同濃度大蒜汁對灰霉、黑曲霉、青霉和根霉熏蒸后的抑制率和直接接觸后的抑菌效果見圖9、圖10和表3。

圖9 4種致腐菌的體外熏蒸試驗——B組

圖10 4種致腐菌的體外熏蒸試驗——B組

大蒜汁濃度(%)體外熏蒸抑制率(%)/直接接觸抑菌敏感度灰霉黑曲霉青霉根霉10023.3 中34.6 高26.1中24.9中5018.2 中31.7 中23.9中18.5中2515.7 中29.2 中16.5 中11.9低12.510.5 低23.4 中14.3 低7.7低6.253.1 低16.9 中12.1 低4.9低3.131.0 低12.8 低9.3 低0.1不敏感00.0不敏感0.0 不敏感0.0 不敏感0.0不敏感

由表3可知，B組中大蒜汁對4種致腐菌的抑制作用均弱于A組，且對同一菌種的抑菌圈直徑也小于A組，但仍都符合A組中大蒜汁濃度越大抑菌效果越好的規(guī)律。B組中100%濃度的大蒜汁僅對黑曲霉的抑制率超過了30%和有高度敏感抑菌效果，大蒜汁在相同濃度條件下對黑曲霉的熏蒸抑制作用最強，其次是青霉，100%濃度的大蒜汁對青霉、灰霉和根霉均為中度敏感抑菌效果；50%濃度大蒜汁對4種致腐菌均為中度敏感抑菌效果，25%濃度大蒜汁對青霉、灰霉和黑曲霉均為中度敏感抑菌效果，但對根霉為低度敏感抑菌效果，對灰霉和根霉幾乎無抑菌作用；3.13%濃度的大蒜汁對黑曲霉的抑制率達(dá)到12.8%，對灰霉和根霉沒有抑菌效果，但對青霉仍有低敏感抑菌效果?？傊?，12.5%濃度以上的大蒜汁對灰霉的抑制作用較明顯，25%濃度以上的大蒜汁對根霉的抑制作用較明顯；12.5%和6.25%濃度的大蒜汁僅對黑曲霉為中度敏感抑菌效果，對灰霉、青霉和根霉均為低度敏感抑菌效果。由表3可知，黑曲霉的抑菌效果最強，青霉、根霉、灰霉依次降低。

最頂端的對照為對照水對菌的作用，其他6個平板為相應(yīng)大蒜汁對菌的抑制效果。

2.4 大蒜汁對4種致病菌的MIC和MBC

A組和B組大蒜汁對灰霉、黑曲霉、青霉和根霉的MIC(最小抑菌濃度)和MBC(最小殺菌濃度)的結(jié)果見表4和表5。

表4 A組大蒜汁對4種致腐菌的MIC和MBC

注：“+”(陽性)表示無抑制作用；“-”(陰性)表示有抑制作用。

由表4可知，A組大蒜汁對灰霉的殺菌和抑菌作用均較好，MIC和MBC均為12.5%；對黑曲霉的殺菌和抑菌作用都較好，尤其是抑菌作用，MIC和MBC分別為6.25%和12.5%；對青霉的抑制作用較好，但殺菌效果較差，MIC和MBC分別為6.25%和25%；對根霉的殺菌作用一般，MIC和MBC分別為12.5%和25%。

表5 B組大蒜汁對4種致腐菌的MIC和MBC

注：“+”(陽性)表示無抑制作用；“-”(陰性)表示有抑制作用。

由表5可知，B組陳大蒜汁對4種致腐菌的MIC和MBC均較高。對灰霉和根霉的抑制作用較差，50%濃度以下的大蒜汁平板均有菌落出現(xiàn)，MIC和MBC均高達(dá)50%；對黑曲霉的殺菌作用相比于其他3種菌要好，MIC和MBC均為12.5%；對青霉的抑制作用較好但殺菌作用不強，MIC和MBC分別為12.5%和25%。

3 結(jié)論

相同情況下，高濃度的大蒜汁比低濃度的大蒜汁抑菌率高，這可能與大蒜汁中的有效抑菌成分高低相關(guān)。陳大蒜比新鮮大蒜汁的抑菌效果差很多，但仍有較弱的抑菌效果且其在低濃度下直接接觸抑菌的效果明顯不如新鮮的大蒜汁，對根霉的抑制效果表現(xiàn)最差，25%濃度的大蒜汁存放12 d對根霉的抑菌效果僅為低度敏感，3.13%濃度的陳大蒜汁對根霉為不敏感抑菌效果，與空白組相同，這可能與大蒜汁中的抑菌成分分解有關(guān)。

大蒜汁的新鮮度對灰霉和根霉的抑制作用影響較大。陳大蒜汁對灰霉和根霉的MIC和MBC均高達(dá)50%，其對青霉和黑曲霉的MIC和MBC也均較新鮮的大蒜汁高。新鮮大蒜汁對灰霉的殺菌作用較好，MIC和MBC均為12.5%；對黑曲霉的抑制作用較好，MIC和MBC分別為6.25%和12.5%。新鮮大蒜汁在抑菌方面整體表現(xiàn)更好，對黑曲霉和根霉有較高的抑制率，在實際應(yīng)用中可優(yōu)先選用此方法防治葡萄曲霉病?？紤]到其天然、無副作用的性能，其應(yīng)用前景可觀。