t10,c12-CLA對(duì)豬皮下和背最長肌脂肪前體細(xì)胞增殖與分化的影響

杜瑞平 高 民 盧德勛

共軛亞油酸（CLA）即共軛十八碳二烯酸，是必需脂肪酸亞油酸（LA）衍生的共軛雙烯的多種位置與空間異構(gòu)體的總稱。CLA在不同的動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出提高免疫力效應(yīng)、抗癌效應(yīng)、降血脂和膽固醇效應(yīng)；此外，CLA作為營養(yǎng)再分配劑能降低體脂、提高瘦肉率、改善肉品質(zhì)[1]。目前CLA的生物調(diào)控作用已成為醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。肌內(nèi)脂肪與豬肉的肉質(zhì)關(guān)系密切[2]，因此在豬肉品質(zhì)調(diào)控中，如何在保持較少皮下脂肪沉積的同時(shí)提高肌內(nèi)脂肪的含量成為目前豬肉質(zhì)調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。諸多國內(nèi)外的研究報(bào)道已表明，日糧中添加CLA能夠顯著抑制豬皮下脂肪沉積，提高瘦肉率[3－5]，同時(shí)能提高肌內(nèi)脂肪含量，改善豬肉品質(zhì)[6－8]。這些結(jié)論表明，CLA對(duì)豬皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控存在差異，但具體機(jī)制尚不清楚。

CLA混合異構(gòu)體中只有c9，t11和t10，c12是最主要的生物活性異構(gòu)體。c9,t11－CLA在提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力、抗癌和提高動(dòng)物的生長性能等方面作用較大[9－10],而t10,c12－CLA在改變動(dòng)物機(jī)體的脂肪代謝方式以及降低脂肪在動(dòng)物體內(nèi)的沉積方面起主要作用[1,11]。盡管t10,c12－CLA降低體脂沉積的效果已得到大多數(shù)試驗(yàn)研究的證實(shí)，但其作用機(jī)理尚未研究清楚。動(dòng)物脂肪的沉積主要取決于脂肪細(xì)胞的數(shù)量與體積,即脂肪前體細(xì)胞的增殖與分化能力，脂肪前體細(xì)胞的增殖與分化受機(jī)體內(nèi)各種因子和營養(yǎng)因素的調(diào)控[12]。目前關(guān)于CLA對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的試驗(yàn)結(jié)論還存在差異[13－15]。鑒于 c9，t11－CLA 和 t10，c12－CLA在調(diào)控動(dòng)物機(jī)體代謝方面的不同，本研究在建立30日齡豬皮下脂肪和背最長肌組織塊體外培養(yǎng)體系以及兩個(gè)部位前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，采用MTT法、油紅O染色及熒光定量PCR技術(shù)從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度和脂肪前體細(xì)胞分化調(diào)控角度探討t10，c12－CLA豬皮下和背最長肌脂肪前體細(xì)胞增殖與分化的影響，為揭示CLA對(duì)豬皮下和肌內(nèi)脂肪沉積的差異調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院豬場30日齡豬。

1.2 試驗(yàn)試劑

t10，c12－CLA 購買自 Matreya公司；胰島素、地塞米松、甲基異丁基黃嘌呤、青霉素和鏈霉素購買自Sigma公司；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白和膠原酶Ⅱ購買于Gibico公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和普通PCR反應(yīng)所用試劑及定量PCR試劑盒（SYBR Green PCR Kit）購自上海生物工程技術(shù)有限公司；DNA Marker（DL1000）購自 TAKARA 公司，其余化學(xué)試劑購自南京建成生物試劑公司。

1.3 主要溶液配制

DMEM/F12培養(yǎng)液：10.0 g/l DMEM/F12培養(yǎng)基，三蒸水，10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素，1.2 g/l NaHCO3，過濾（0.22 μm 濾膜）除菌，分裝，4℃?zhèn)溆谩?/p>

組織消化液：Ⅱ型膠原酶配成1mg/ml HBSS液，過濾除菌，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

100 μmol/l CLA 液:先用 100 μl無水乙醇溶解25mg CLA，加入8.93 ml培養(yǎng)液配成0.01 mol/l的母液，濾菌，－20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋即可。

分化儲(chǔ)備液：分別稱取胰島素5.00mg、地塞米松0.2mg、甲基異丁基黃嘌呤55.63mg溶于500 μl無水乙醇中，待完全溶解后加三蒸水至50 ml，濾菌，－20℃保存。

MTT溶液：將5mg MTT溶于1 ml培養(yǎng)液，過濾除菌，4℃避光保存。

油紅O染液：混合0.7 g油紅O與200 ml純異丙醇，室溫過夜，濾紙濾過，用120 ml蒸餾水稀釋180 ml染液，置4℃過夜后室溫保存。

1.4 組織塊培養(yǎng)[16]

（1）無菌切取仔豬肩胛部皮下脂肪約5 g、背最長肌約 8 g，75%酒精中浸泡 3～5 s，然后用 D－Hanks液清洗3次，置于消毒的Hanks液中；（2）在培養(yǎng)液或者平衡鹽溶液中分離去除組織中可見的纖維及血管,反復(fù)剪切至1 mm3大小為止（呈糊狀）。然后用吸管吸取Hanks液把附著在剪刀上的組織小塊沖下，并補(bǔ)加3～5 ml Hanks液后，去上清，余下的組織塊即可用于培養(yǎng)；(3)用眼科探針將組織小塊均勻擺布于60 cm的培養(yǎng)皿，置 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱1～2 h左右，再向底部輕輕注入5 ml完全培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱 (37°C,5%CO2)中靜置培養(yǎng)，開始2 d盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長，培養(yǎng)第3 d換液，此后每2 d換液一次。細(xì)胞匯合后用基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗（一定不要剩余血清）,然后改用無血清分化培養(yǎng)液培養(yǎng)至第10 d。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖[16]

（1）前脂肪細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：將組織塊在培養(yǎng)液或者平衡鹽溶液中剪碎后，靜置，吸去上清液，把組織轉(zhuǎn)入消化瓶中，加組織消化液，置37℃振蕩搖床內(nèi)(40 r/min)孵育60～80 min后取出；把消化成糊狀的組織轉(zhuǎn)入50 ml離心管中，1 000 r/min，室溫離心5～10 min；棄上清，加入含血清的培養(yǎng)液以終止蛋白酶活性，無血清培養(yǎng)液洗2遍，在沉積上留少量液體(0.5 ml)；用吸管反復(fù)吹打，使成懸液，通過70目和300目細(xì)胞篩濾過入干凈的消毒離心管中，1 000 r/min室溫離心10 min，吸出上清液，用適量基礎(chǔ)培養(yǎng)液漂洗；把細(xì)胞沉積重懸于5～10 ml完全培養(yǎng)液吹打均勻，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度，以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加180 μl完全培養(yǎng)液。接種后1 d換液，此后每隔 2 d 換液一次。分別在試驗(yàn) 1、2、3、5、7、9 d 取一塊培養(yǎng)板終止培養(yǎng)。

（2）測定時(shí)每孔加入20μlMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4h。

（3）吸去100 μl培養(yǎng)液，加入等量DMSO使結(jié)晶物充分溶解，在微型振蕩器振蕩5 min。

（4）在酶標(biāo)儀上測定光吸收。測定波長為490 nm，參考波長為630～690 nm。

以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸，繪制曲線。同時(shí)與試驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，其它試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。

1.6 油紅O染色[17]

①培養(yǎng)第8 d，吸出培養(yǎng)液，PBS液漂洗2次，加1 ml 10%的甲醛固定，室溫過夜；②去除甲醛用60%的異丙醇洗30 min；③用油紅O染色1 h，去除染液，用60%的異丙醇洗5 s并不斷搖動(dòng)，用水徹底沖洗后干燥；④顯微鏡下觀察，在510 nm處比色，記錄吸光度值。

1.7 熒光定量PCR

1.7.1 引物設(shè)計(jì)與合成（見表1）

登陸NCBI網(wǎng)站查詢相關(guān)基因序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)PCR特異引物，委托上海生物工程公司合成。將凍干粉狀態(tài)的引物離心后，用滅菌超純水配制成 100 μmol/l貯備液和 20 μmol/l工作液，－20 ℃保存。

1.7.2 熒光定量PCR

定量PCR反應(yīng)體系見表2。優(yōu)化反應(yīng)程序如下：①95℃預(yù)變性 15 min；②95℃變性 30 s；③53～60℃退火30s；④72℃延伸30s，循環(huán)40次；⑤72℃延伸1 min；⑥70～95℃生成融解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，樣品保存于－20℃環(huán)境中備用。

1.8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 引物設(shè)計(jì)參數(shù)

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

共設(shè)2個(gè)處理，處理1為陰性對(duì)照（添加0.1 mmol/l BSA），處理 2 添加 100 μmol/l的 t10，c12－CLA，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)平行，培養(yǎng)開始即加入BSA與t10，c12－CLA進(jìn)行處理至第10 d。試驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞提取RNA在－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件中單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05時(shí)確定為差異顯著，P＜0.01時(shí)確定為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 t10,c12－CLA對(duì)豬皮下與背最長肌脂肪前體細(xì)胞增殖的影響（見圖1、圖2）

圖1 MTT測定t10,c12－CLA對(duì)皮下與肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖的影響

MTT法是檢測細(xì)胞相對(duì)活力和增殖情況的經(jīng)典方法，圖1和圖2為豬皮下脂肪和背最長肌兩個(gè)部位的 t10,c12－CLA 處理組與對(duì)照組在第 1、2、3、5、7 和 9 d時(shí)的MTT測定結(jié)果。結(jié)果表明，兩個(gè)部位不管是t10,c12－CLA處理組還是對(duì)照組，細(xì)胞生長第2 d均進(jìn)入增殖潛伏期，第3～7 d生長旺盛，進(jìn)入指數(shù)期，8 d后長勢漸緩，進(jìn)入平臺(tái)期。各組前脂肪細(xì)胞的生長曲線近似“S”形。

圖2 MTT測定t10,c12－CLA對(duì)皮下與肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果進(jìn)一步顯示，100 μmol/l t10,c12－CLA對(duì)豬皮下前脂肪細(xì)胞的增殖影響在第1、2 d差異不顯著，第3 d后均顯著抑制其增殖（P＜0.05）；而該劑量對(duì)豬肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的增殖影響測定全期均不顯著（P＞0.05）。已有的文獻(xiàn)表明，t10，c12－CLA 能顯著抑制人前脂肪細(xì)胞和 3T3－L1前脂肪細(xì)胞的增殖[18－19]。Meadus等（2002）的研究表明，各CLA異構(gòu)體對(duì)豬的前脂肪細(xì)胞增殖沒有影響[20]，而 Brandebourg 和 Hu（2005）則報(bào)道，t10，c12－CLA顯著抑制了體外培養(yǎng)的豬前脂肪細(xì)胞的增殖[13]。本研究結(jié)果則表明100 μmol/l t10,c12－CLA處理對(duì)豬皮下脂肪和背最長肌兩個(gè)部位前體脂肪細(xì)胞的增殖影響存在差異且伴隨時(shí)間效應(yīng)。

2.2 t10,c12－CLA對(duì)豬皮下與背最長肌脂肪前體細(xì)胞分化的影響（見圖3）

圖3為試驗(yàn)第8 d分化后期豬皮下和背最長肌兩個(gè)部位脂肪前體細(xì)胞油紅O染色提取分析結(jié)果。結(jié)果表明，兩個(gè)部位脂肪細(xì)胞均脂滴積聚明顯，皮下部位的t10,c12－CLA處理組油紅O染色OD值顯著下降（P＜0.05），相反背最長肌部位的 t10,c12－CLA 處理組油紅O染色OD值顯著上升（P＜0.05），這充分說明100 μmol/l t10,c12－CLA顯著抑制了豬皮下前脂肪細(xì)胞分化而促進(jìn)了背最長肌前脂肪細(xì)胞分化。結(jié)合MTT檢測與油紅O染色的結(jié)果表明，100 μmol/l t10,c12－CLA（10 d處理）顯著抑制了豬皮下前脂肪細(xì)胞增殖與分化，促進(jìn)了背最長肌前脂肪細(xì)胞的分化（P＜0.05），但對(duì)背最長肌前脂肪細(xì)胞的增殖影響并不顯著，該結(jié)論與部分學(xué)者報(bào)道一致。也從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度充分說明t10,c12－CLA對(duì)豬皮下和背最長肌脂肪前體細(xì)胞增殖與分化存在差異調(diào)控作用，具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步明確。

圖3 油紅O測定t10,c12－CLA對(duì)皮下與肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化的影響

2.3 t10,c12－CLA對(duì)豬皮下與背最長肌脂肪前體細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的影響（見圖4）

圖4 轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、ADD1和C/EBPα的相對(duì)基因表達(dá)水平

圖4為熒光定量PCR測定三大分化轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα及ADD1的相對(duì)定量結(jié)果,結(jié)果表明，100 μmol/l t10,c12－CLA顯著抑制了豬皮下脂肪PPARγ的基因表達(dá)，促進(jìn)了豬背最長肌的PPARγ與ADD1 的基因表達(dá)（P＜0.05），而對(duì)皮下脂肪 C/EBPα、ADD1及背最長肌的C/EBPα基因表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05）。PPARγ、C/EBPα 及 ADD1是調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們彼此協(xié)作促進(jìn)與脂肪終末分化有關(guān)的特異性基因表達(dá)，在脂肪細(xì)胞分化過程中起正向調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是脂肪形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PPARγ控制脂肪的儲(chǔ)存和釋放，維持機(jī)體能量平衡，調(diào)節(jié)胰島素抵抗及血糖的穩(wěn)定，促進(jìn)脂肪細(xì)胞特異性基因表達(dá)[21]。而C/EBPα能結(jié)合和反式激活許多脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄,如AP2、SCD1、GLUT－4、PEPCK、Leptin和 INSR 等基因，在脂肪細(xì)胞分化后期發(fā)揮了重要作用[22]。ADD1是動(dòng)物脂肪代謝中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它通過調(diào)節(jié)LDLR、ACC、FAS和PEPCK等有關(guān)脂肪合成和葡萄糖代謝的基因來調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的脂肪合成[23]。Tsuboyama等（2003）證明，在體內(nèi)CLA能降低ADD1基因mRNA水平的表達(dá)，從而抑制PPARγ的表達(dá)和活性[24]。Brown等（2003）報(bào)道，在人類前脂肪細(xì)胞中，t10，c12－CLA可減少PPARγ的表達(dá)，使甘油三酯減少[25]。通過對(duì)小鼠、人和豬的脂肪組織及3T3－L1前脂肪細(xì)胞系的研究表明，添加 CLA（主要是 t10，c12－CLA）使 PPARγ 基因表達(dá)顯著下降[14－15]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明 t10，c12－CLA 顯著影響了豬皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪的PPARγ的表達(dá)進(jìn)而影響了兩個(gè)部位前脂肪細(xì)胞的分化。

3 討論

目前，關(guān)于CLA對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖和分化的研究模型多集中在體外培養(yǎng)的人和嚙齒類動(dòng)物前脂肪細(xì)胞或細(xì)胞系（如 3T3－L1）上[11,14－15,18－19,25,29－30]，豬上的研究并不多見[13,20,27－28]，而且研究結(jié)論并不一致，試驗(yàn)條件（培養(yǎng)條件、細(xì)胞來源、CLA來源、處理時(shí)間等）的差異可能是造成這些報(bào)道結(jié)果不同的主要原因。關(guān)于CLA對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響，人前脂肪細(xì)胞分化的體外研究表明，t10，c12－CLA能顯著降低人前脂肪細(xì)胞的分化以及脂肪細(xì)胞中脂類物質(zhì)的沉積[15]。t10，c12－CLA對(duì)3T3－L1前脂肪細(xì)胞的分化過程也有顯著的抑制作用[14,19]。Ding等（2000）結(jié)果表明，CLA處理促進(jìn)豬前脂肪細(xì)胞的分化[26]。Meadus等（2002）的研究結(jié)果表明，CLA處理對(duì)豬前脂肪細(xì)胞的分化沒有影響[20]；而 Brandebourg 和 Hu（2005）則報(bào)道，t10，c12－CLA能顯著抑制豬前脂肪細(xì)胞的分化和甘油三酯的沉積[13]。周玄（2007）研究了CLA混合體和單體對(duì)新生仔豬皮下脂肪和肌肉內(nèi)血管基底細(xì)胞中脂類生成的影響，研究表明，t10，c12－CLA抑制了該部位脂肪前體細(xì)胞的增殖和分化；同時(shí)促進(jìn)了肌肉內(nèi)血管基底細(xì)胞分化，但對(duì)其增殖沒有影響[27]。

本試驗(yàn)中，結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們可以得出這樣的推斷，即t10,c12－CLA通過下調(diào)豬皮下脂肪內(nèi)PPARγ的基因表達(dá)，進(jìn)而可能抑制皮下前脂肪細(xì)胞分化，最終降低豬皮下脂肪沉積；相反t10,c12－CLA通過上調(diào)豬背最長肌的PPARγ與ADD1的基因表達(dá)，進(jìn)而可能促進(jìn)肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞分化并最終提高肌內(nèi)脂肪沉積。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，100 μmol/l t10,c12－CLA 顯著抑制了豬皮下前脂肪細(xì)胞增殖與分化及PPARγ的基因表達(dá)，促進(jìn)了豬背最長肌的前脂肪細(xì)胞分化及PPARγ與ADD1的基因表達(dá)，這些結(jié)果從脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分化轉(zhuǎn)錄因子角度初步揭示了t10,c12－CLA對(duì)豬皮下和背最長肌脂肪沉積的差異性調(diào)控作用。

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