疑似非洲豬瘟病料的采集、保存和送檢

陳峰　黨安坤　徐淑華　楚遵鋒　曹振山　陸峰　藺曉月　蘭鄒然

摘要：非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染引起的豬的急性、熱性和高度接觸性傳染病，自2018年8月3日發(fā)現(xiàn)第一例非洲豬瘟疫情起截止2018年底，全國共有20多個(gè)省份發(fā)生近100起家豬及2起野豬感染非洲豬瘟疫情。全國啟動(dòng)了重大疫情Ⅰ級響應(yīng)，防控形勢險(xiǎn)峻。這使得基層獸醫(yī)工作者和防疫員等工作人員更要在病料采集和儲(chǔ)存等工作中注重生物安全和防范意識。筆者從病料采集、樣品保存和樣品運(yùn)輸三個(gè)方面探討了當(dāng)下實(shí)際操作中應(yīng)該注意的操作事項(xiàng)，并通過相關(guān)資料整理了規(guī)范的操作方法僅供大家參考。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟;病料采集;基層獸醫(yī);防疫員

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒感染引起的豬的急性、熱性和高度接觸性傳染病，臨床以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血及高死亡率為特征，屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）要求法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。中國動(dòng)物病原微生物名錄中，其被列為一類動(dòng)物疫病。中國自2018年8月3日發(fā)生第一例非洲豬瘟疫情起，截止2018年底，中國共有20多個(gè)省份發(fā)生近100起家豬及2起野豬感染非洲豬瘟疫情。中國啟動(dòng)了重大疫情Ⅰ級響應(yīng)，防控形勢險(xiǎn)峻。這使得基層獸醫(yī)工作者和防疫員等工作人員更要在病料采集與儲(chǔ)存等工作中注重生物安全和防范意識。筆者為此，把病料采集、保存和運(yùn)輸方面相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)資料和自身實(shí)踐操作中注意事項(xiàng)進(jìn)行了整理，希望能為廣大獸醫(yī)工作者提供幫助。

1臨床及病理診斷

1.1臨床癥狀

體溫通常升至41℃以上，食欲廢絕、怕冷;皮膚潮紅充血甚至發(fā)紺，在耳、鼻、腹壁、尾、外陰和肢端等無毛或少毛部位更為明顯，甚至呈淤斑、血腫和壞死斑;在病后期常伴有出血性腸炎，表現(xiàn)腹瀉和血便等癥狀。

1.2病理變化

因血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損而導(dǎo)致各器官組織發(fā)生嚴(yán)重的充血、出血、水腫、壞死和梗死等，淋巴結(jié)腫脹，邊緣呈紅色，以腸系膜淋巴結(jié)等出血最為嚴(yán)重，呈紫紅色，如血瘤狀。在喉頭、膀胱黏膜和心肺等實(shí)質(zhì)器官表面呈點(diǎn)狀出血。實(shí)質(zhì)器官中脾臟病理變化較為明顯，充血腫大，多呈黑色。心包積液，胸水和腹水增多。

2樣品的采集

2.1病原學(xué)檢測的樣品采集

2.1.1血液病豬血液的采集一般采用耳靜脈或前腔靜脈采血方式，先用注射器吸取枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑，再采集血液5mL，顛倒混勻后，注入無菌容器，如條件允許，最好每份血液

樣品采集2管，作為備份樣品保存。因采血管的普及，也可用已經(jīng)含有抗凝劑的真空采血器直接抽取血液。

2.1.2實(shí)質(zhì)器官檢測非洲豬瘟病毒，脾臟是最重要的器官，首先選擇脾臟，其次是淋巴結(jié)。解剖病豬時(shí)，無論其脾臟和淋巴結(jié)有無病理變化，都應(yīng)在采集樣品范圍之內(nèi)。采取淋巴結(jié)時(shí)多同周圍脂肪整個(gè)采取。其他器官可選擇有病變且明顯的部位，以無菌器械采取直徑1cm左右的組織樣品，加入到含有100μg/mL青霉素和鏈霉素的PBS溶液中，4℃保存運(yùn)輸?；虮４嬗诤?0%甘油的PBS溶液中，4℃保存運(yùn)輸。為保持病毒的感染性，樣品送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即放入-80℃低溫冰箱內(nèi)冷凍保存。

2.1.3其他樣品鼻液：可以用滅菌棉拭子擦取鼻黏膜上的分泌物，保存于無菌容器內(nèi)。糞便：用清潔的玻璃棒等，挑取新鮮糞便少許，約1g左右，保存于無菌容器內(nèi);也可用棉拭子，在直腸內(nèi)直接掏取。仔豬尸體和流產(chǎn)胎兒：應(yīng)用滅菌紗布包裹后，裝入能密封的塑料袋中，保持低溫，一般建議-40℃以下最佳，并整體送檢。

非洲豬瘟比普通豬瘟造成的豬喉及會(huì)厭部位瘀斑充血以及出血更為嚴(yán)重。這些部位也可以作為病料采集。另外，蜱在非州和歐洲很多國家是重要的生物蟲媒，但是在中國還未見相關(guān)報(bào)道。對于蜱的采集一般使用手工方式，但比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。在非洲和歐洲一些國家采用二氧化碳誘捕法和真空抽吸法等方法用于大規(guī)模的田間蜱樣品采集。

2.2血清學(xué)檢測的樣品采集

對于疑似非洲豬瘟的病豬進(jìn)行血清學(xué)樣品采集時(shí)，需要對患病豬、健康豬以及處于不同發(fā)病階段的豬，分別無菌采集血清。采集全血3-5mL，可以室溫放置12-24h，收集自然析出的血清，現(xiàn)如今更普遍使用離心分離血清的方法。收集的血清置于無菌器皿中，密封，標(biāo)記后送檢。

2.3病理組織學(xué)檢測的樣品采集

解剖有典型病變的部位，連同附近的健康組織一起采集。一個(gè)組織器官上如有不同病變時(shí)，應(yīng)分別采集。取出的樣品用清水沖洗血污后，立即放入固定液中。采集的樣本應(yīng)切成1-2cm左右大小。使用的固定液為10%的福爾馬林，固定液的用量應(yīng)為標(biāo)本體積的10倍以上。

2.4采集注意事項(xiàng)

2.4.1樣品取材合乎規(guī)范當(dāng)懷疑病豬是非洲豬瘟?xí)r，應(yīng)按照《非洲豬瘟防治計(jì)劃規(guī)范》的詳細(xì)要求，進(jìn)行病料采集，同時(shí)懷疑患有其他感染疾病時(shí)，應(yīng)綜合分析，全方位取材。死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)取材，夏季一般不超過4h，以防止被取材動(dòng)物組織出現(xiàn)腐敗、自溶和變性等情況影響檢測結(jié)果。

2.4.2避免交叉污染，注重生物安全時(shí)刻保持避免交叉污染的頭腦意識，以免因污染而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。取材現(xiàn)場要注重生物安全工作，做好個(gè)人的防護(hù)工作，并采取必要的措施防止污染環(huán)境，避免人為散播疫病。更應(yīng)該做好環(huán)境消毒和動(dòng)物尸體的無害化處理等工作。

3樣品保存的注意事項(xiàng)

3.1血液類樣品

血清或抗凝全血送檢應(yīng)放置于4℃保存，冷藏送至檢測實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)置于-20℃保存。如需要長時(shí)間保存應(yīng)放置于-80℃超低溫冰箱中。

3.2組織樣品

例如脾臟和淋巴結(jié)等可在50%中性甘油溶液或含IOOμg/mL青霉素和鏈霉素的PBS溶液中4℃冷藏運(yùn)輸。到檢測實(shí)驗(yàn)室后立即存放于-80℃超低溫冰箱中。

3.3注意事項(xiàng)

所用到的保存液，需要充分滅活，要確保容器的密封性無誤。保存時(shí)要把檢品做好分類，填寫相應(yīng)的標(biāo)簽便于尋找和取用。要時(shí)刻有保持新鮮及避免污染的操作意識。

4送檢運(yùn)輸中樣品注意事項(xiàng)

4.1選擇合適的包裝

樣品的包裝應(yīng)符合《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》《高致病性動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理審批辦法》《高致病性動(dòng)物病原微生物菌（毒）種或者樣品運(yùn)輸包裝規(guī)范》，并且要同時(shí)符合航空、鐵路和公路等交通管理的相關(guān)規(guī)定。

使用與冷藏時(shí)間相匹配的冷藏設(shè)備，如需要冷藏時(shí)間過長，中途可更換冷卻劑。根據(jù)路途長短選用相應(yīng)的儲(chǔ)存容器。更應(yīng)充分考慮到運(yùn)輸過程中可能發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，例如撞擊和震動(dòng)。盡量使用不易破碎的容器。

4.2做好相關(guān)的登記

在內(nèi)容物和外包裝上，進(jìn)行編號，并詳加記錄，填寫送檢單時(shí)應(yīng)一式三份或多份，并做好存檔工作，運(yùn)輸前應(yīng)事先與檢驗(yàn)檢測單位取得聯(lián)系，并且以書面或者電話的方式做好疫情的說明。條件允許的情況下，盡量指派專人送檢。

5總結(jié)

非洲豬瘟疫情正在中國發(fā)生。在防控的關(guān)鍵時(shí)期如何做好非洲豬瘟病料的采集和送檢，至關(guān)重要。采集好病料并安全送檢，一方面能提供有價(jià)值的樣品，對非洲豬瘟的確診提供有效的樣品支持;另一方面在非洲豬瘟疫區(qū)規(guī)范的取材和運(yùn)輸，能減少環(huán)境污染和運(yùn)輸沿線的污染，切斷一條重要的污染途徑。在取材的地點(diǎn)，應(yīng)提前對環(huán)境進(jìn)行防護(hù)和消毒工作。避免因取材而導(dǎo)致的病原微生物的擴(kuò)散，污染養(yǎng)殖場。保存運(yùn)輸方面，應(yīng)掌握“保持新鮮，避免污染”的原則。

當(dāng)然，非洲豬瘟的傳播途徑是復(fù)雜多樣的，只有更全面的加強(qiáng)防控意識和防控手段，才可能更有效的對非洲豬瘟實(shí)施防控。疾病的發(fā)生都具有一定的復(fù)雜性，往往可能是多種疾病混合感染導(dǎo)致的，在取材過程當(dāng)中應(yīng)結(jié)合病癥和病理變化進(jìn)行取材。

目前雖然仍在研制開發(fā)疫苗，但尚未成功，且無有效的治療方法。一旦確診發(fā)生本病，應(yīng)采取嚴(yán)格封鎖和強(qiáng)制性的撲殺措施。并對疫區(qū)周圍豬群進(jìn)行細(xì)致的血清學(xué)檢查，排除隱性感染豬的存在。