肺結(jié)核患者外周血和支氣管肺泡灌洗液Vδ2+ T淋巴細(xì)胞比例的臨床意義▲

曹秀廷 王兆芬

(青海省第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，西寧市 810000，電子郵箱：1907028184@qq.com)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性疾病，其死亡率居單一病原體感染的疾病之首。近年來，肺結(jié)核的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)報(bào)告，我國(guó)肺結(jié)核的發(fā)病率居世界第3位，而且，隨著耐藥病菌的出現(xiàn)，該疾病已對(duì)人類生命安全造成重大威脅[1]。目前，人體抗結(jié)核感染相關(guān)的免疫機(jī)制尚未完全闡明，研究證實(shí)αβ T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在結(jié)核感染中發(fā)揮重要作用，γδ T淋巴細(xì)胞在結(jié)核桿菌感染的免疫調(diào)控中亦發(fā)揮重要作用[2]。Vδ2+T淋巴細(xì)胞作為γδ T淋巴細(xì)胞的主要亞群，不僅具有先天免疫細(xì)胞的特征，亦具有適應(yīng)性免疫的特征，可通過分泌不同功能的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，但目前有關(guān)Vδ2+T淋巴細(xì)胞在結(jié)核病中相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究相對(duì)較少[3]。本研究探討肺結(jié)核患者外周血及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中Vδ2+T淋巴細(xì)胞的比例及血清相關(guān)細(xì)胞因子的水平，以期為結(jié)核病的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月至2017年2月在我院就診的肺結(jié)核患者82例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡21～65歲；(2)均為新發(fā)確診患者；(3)所有研究對(duì)象均知曉本研究目的，簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有自身免疫性疾病、心腦血管等嚴(yán)重疾病者；(2)有糖尿病、高血壓等并發(fā)癥者；(3)臨床資料不全者。其中活動(dòng)性肺結(jié)核患者37例(活動(dòng)性肺結(jié)核組)，潛伏性肺結(jié)核患者45例(潛伏性肺結(jié)核組)?；顒?dòng)性肺結(jié)核組男性25例，女性12例，年齡21～62(41.23±5.67)歲，體質(zhì)指數(shù)18.25～24.18(22.05±2.13)kg/m2，吸煙或有吸煙史者20例；潛伏性肺結(jié)核組男性30例，女性15例，年齡24～65(42.12±6.35)歲，體質(zhì)指數(shù)18.50～24.33(22.25±1.95)kg/m2，吸煙或有吸煙史者28例。另選取同期健康體檢者40名作為健康組，其中男性25例，女性15例，年齡22～63(40.95±5.52)歲，體質(zhì)指數(shù)18.33～24.25(21.89±1.88)kg/m2，吸煙或有吸煙史者21例。3組研究對(duì)象體質(zhì)指數(shù)、性別、年齡及吸煙情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 健康組患者無結(jié)核病臨床癥狀，相關(guān)影像學(xué)檢查均無結(jié)核病征象，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)結(jié)果為陰性。潛伏性肺結(jié)核組患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)與肺結(jié)核人群有密切接觸；(2)TST檢測(cè)陽(yáng)性；(3)患者無明顯臨床癥狀，影像學(xué)檢查呈陰性。活動(dòng)性肺結(jié)核患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)有咳嗽、出血癥狀；(2)影像學(xué)檢查顯示肺部陰影；(3)TST檢測(cè)陽(yáng)性。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集：(1)血清標(biāo)本采集：采集所有研究對(duì)象入院次日清晨或體檢當(dāng)日清晨空腹外周靜脈血3 mL，置于枸櫞素鈉抗凝管中，一部分血標(biāo)本以3 500 r/min離心后取上清，另一部分標(biāo)本加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)以1 ∶1比例稀釋后轉(zhuǎn)入預(yù)先裝有3 mL淋巴細(xì)胞分離液的15 mL離心管中，600 r/min離心15 min，棄上清以10 mL PBS重懸后400 r/min離心8 min，采用RPMI 1640(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：20171204)重懸調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×109個(gè)細(xì)胞/L。(2)BALF標(biāo)本收集：采用2%利多卡因?qū)Ψ谓Y(jié)核患者咽部進(jìn)行霧化麻醉，經(jīng)咽部插入BF-F260型纖維支氣管鏡(日本奧林巴斯公司)，進(jìn)入氣管支氣管后通過細(xì)的硅膠管注入2%利多卡因2 mL對(duì)肺部病灶進(jìn)行局部麻醉，通過硅膠管分3次注入150 mL 37℃無菌生理鹽水，采用負(fù)壓法回吸灌洗液，記錄回吸的灌洗液總量，灌洗液回收率超過40%為標(biāo)本收集成功。BALF經(jīng)雙層紗布過濾并采用生理鹽水洗滌兩次后，以RPMI 1640重懸調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×109個(gè)細(xì)胞/L備用。

1.3.2 Vδ2+T淋巴細(xì)胞百分率測(cè)定：取1.3.1獲取的外周血或BALF細(xì)胞懸液100 μL，用含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS洗滌兩次后，加入Vδ2+T的熒光抗體藻紅蛋白抗人T淋巴細(xì)胞抗原受體Vδ2+(T cell receptor Vδ2+，TCRVδ2+)(美國(guó)BD Bioscience公司，批號(hào)：2018020901)和CD3+T的CD3-APC熒光單克隆抗體(美國(guó)BD Bioscience公司，批號(hào)：2018012603)，于4℃條件下避光孵育30 min，再次以含1% BSA的PBS溶液洗滌兩次后加入100 μL 1%的多聚甲醛溶液重懸，于CytomicsTMFC500流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)，采用CXP儀器操控軟件采集前向和側(cè)向散射光信號(hào)，并采用配套軟件CXP 2.2對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，以Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞CD3+T淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)作為Vδ2+T淋巴細(xì)胞的相對(duì)水平。

1.3.3 血清相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)：采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清γ干擾素(interferon,IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)4、IL-10水平，儀器為Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司(批號(hào)分別為CAA31639，P05112，P22301)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較方差分析,兩組間比較采用LSD-t法；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對(duì)象外周血Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞百分比比較 健康組、潛伏性肺結(jié)核組、活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞百分比分別為(8.67±0.56)%、(7.05±0.45)%、(5.54±0.42)%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=408.385，P<0.001)；其中活動(dòng)性肺結(jié)核組和潛伏性肺結(jié)核組患者外周血Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞百分比均低于健康組(均P<0.05)。見圖1。

圖1 3組研究對(duì)象外周血Vδ2+ T淋巴細(xì)胞流式圖(示例)

2.2 活動(dòng)性肺結(jié)核組和潛伏性肺結(jié)核組患者BALF中Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞百分比比較 活動(dòng)性肺結(jié)核組BALF中Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞百分比為(1.92±0.21)%，低于潛伏性肺結(jié)核組的(3.35±0.30)%(t=24.470，P<0.001)。見圖2。

圖2 兩組患者BALF中Vδ2+ T淋巴細(xì)胞流式圖(示例)

2.3 3組研究對(duì)象血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較 潛伏性肺結(jié)核組和活動(dòng)性肺結(jié)核組患者血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平均高于健康組，活動(dòng)性肺結(jié)核組患者血清IL-4、IL-10水平均高于潛伏性肺結(jié)核組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組患者外周血IFN-γ、IL-4、IL-10水平比較(x±s，ng/L)

注：與健康組比較，aP<0.05；與潛伏性肺結(jié)核比較，bP<0.05。

3 討 論

γδ T淋巴細(xì)胞是于1986年發(fā)現(xiàn)的一類特殊T淋巴細(xì)胞，約占T淋巴細(xì)胞的1%～5%，其表面主要表達(dá)由γ和δ鏈組成的多樣性T淋巴細(xì)胞受體，具有與αβ T淋巴細(xì)胞相似的免疫功能，但又有其獨(dú)特特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為無主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制識(shí)別抗原，無須細(xì)胞提呈，兼有天然免疫和適應(yīng)性免疫，具有殺傷和調(diào)節(jié)的雙重功能[4]。γδ T淋巴細(xì)胞主要分為Vδ1+T淋巴細(xì)胞和Vδ2+T淋巴細(xì)胞兩個(gè)亞群，其中Vδ2+T淋巴細(xì)胞是外周血的主要γδ T淋巴細(xì)胞亞群，在正常生理狀態(tài)下占γδ T淋巴細(xì)胞的50%～90%。Vδ2+T淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T cell，Th)1、Th2、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)等多種類型的細(xì)胞因子，在腫瘤免疫和感染免疫中均發(fā)揮不同的免疫作用，同時(shí)能夠向αβ T淋巴細(xì)胞提呈抗原并與刺激信號(hào)協(xié)同促進(jìn)αβ T淋巴細(xì)胞的增殖分化[5]。

目前，γδ T淋巴細(xì)胞的生物學(xué)活性及在機(jī)體不同疾病中所發(fā)揮的作用尚未完全清楚。李元元等[6]研究表明，慢性乙型肝炎病毒感染患者外周血及肝臟內(nèi)Vδ2+T淋巴細(xì)胞亞群的百分比較健康人下降，與肝臟炎癥分級(jí)、纖維化程度及HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，但Vδ1+T淋巴細(xì)胞并無明顯變化，說明炎癥環(huán)境對(duì)Vδ2+T淋巴細(xì)胞具有一定影響，Vδ2+T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降與慢性乙型肝炎病情的發(fā)展有一定的關(guān)系。Rei等[7]指出，γδ T淋巴細(xì)胞能夠招募免疫抑制性骨髓T淋巴細(xì)胞，抑制抗腫瘤反應(yīng)，增強(qiáng)血管新生，參與腫瘤進(jìn)程。馬俊等[8]研究表明，肝癌患者外周血中Vδ2+T淋巴細(xì)胞所占比例低于健康人，導(dǎo)致其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和免疫清除作用降低可能是導(dǎo)致肝癌發(fā)病的原因之一。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者和潛伏性肺結(jié)核患者外周血Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比低于健康對(duì)照組，且活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血和BALF中Vδ2+T淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比低于潛伏性肺結(jié)核患者(均P<0.05)，提示Vδ2+T淋巴細(xì)胞在結(jié)核感染進(jìn)程可能發(fā)揮重要作用，其水平下降可能使機(jī)體免疫反應(yīng)降低，導(dǎo)致機(jī)體無法清除病原體。

以往研究表明肺結(jié)核患者Th1/Th2比例失衡所致細(xì)胞因子發(fā)生變化可能是影響結(jié)核病進(jìn)展的機(jī)制之一[9]。IFN-γ是調(diào)控免疫細(xì)胞活化、對(duì)結(jié)核感染起抵抗作用的Th1型細(xì)胞因子；IL-10和IL-4屬于多功能的Th2型細(xì)胞因子，在結(jié)核分枝桿菌的免疫逃逸和潛伏感染中發(fā)揮重要作用[10]。Chen等[11]研究表明，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中Vδ2+T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別結(jié)核桿菌，在感染早期細(xì)胞的增殖分化能夠產(chǎn)抗結(jié)核桿菌的細(xì)胞因子IFN-γ，減緩肺組織病變進(jìn)程，同時(shí)能夠產(chǎn)生IL-12，增強(qiáng)CD4/CD8 Th1型細(xì)胞的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核病的抵抗能力。本研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期和潛伏期肺結(jié)核患者血清IFN-γ、IL-10、IL-4水平均高于健康人，且活動(dòng)性肺結(jié)核患者IL-10、IL-4水平均高于潛伏性肺結(jié)核患者(均P<0.05)，與張錫林等[12]研究結(jié)果相似。結(jié)合本研究結(jié)果的潛伏期肺結(jié)核患者外周血及BALF中Vδ2+T淋巴細(xì)胞的百分比相對(duì)高于活動(dòng)期患者，血清IL-10和IL-4水平低于活動(dòng)期患者，筆者認(rèn)為Vδ2+T淋巴細(xì)胞在感染初期可以啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)，調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而發(fā)揮抗結(jié)核桿菌感染的作用；而隨著病原菌的不斷刺激，Vδ2+T淋巴細(xì)胞過度活化，F(xiàn)asL誘導(dǎo)凋亡，其調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子分泌的作用減弱，導(dǎo)致IL-10和IL-4過度分泌，機(jī)體免疫平衡失調(diào)，肺結(jié)核病情加重。

綜上所述，肺結(jié)核患者外周血Vδ2+T淋巴細(xì)胞所占比例降低，IFN-γ、IL-10、IL-4水平升高；IL-10和IL-4可能參與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展過程，其分泌可能受到Vδ2+T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)。