市售與自制艾葉油性狀及成分對比分析

趙譽夢 熊維政 李 磊 郭 立

艾葉是我國傳統(tǒng)中藥材，最早在《詩經(jīng)》中就有記載，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛等作用[1]，主產(chǎn)于河南、河北、安徽、湖北、山東、江西等地。其化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)及微量元素等[2]；其藥理作用廣泛：鎮(zhèn)痛抗炎、抑菌抗氧化、止血凝血、保肝利膽等作用[3～5]。其中揮發(fā)油成分為學(xué)者普遍研究的對象，主要有α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片、丁子香酚、艾蒿酮、艾蒿醇等[6]，艾葉揮發(fā)油成分最初只提取出了十幾種，現(xiàn)在用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測出來的結(jié)果可達一百多種。也有相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用及研制，如艾葉油軟膠囊、艾葉油納米乳劑及新型艾灸貼產(chǎn)品[7]。其抗菌抗炎、平喘的作用也得到證實[8]。目前其應(yīng)用集藥品、食品、保健品等于一體，具有廣闊的開發(fā)前景。同時艾葉的衍生品艾灸也是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分，其臨床應(yīng)用廣泛、療效卓著。隨著科技的進步及人們保健意識增強，艾灸作為綠色養(yǎng)生自然療法備受關(guān)注。同時，對其現(xiàn)代相關(guān)研究也提出新的要求。本研究就市售艾葉油與自制艾葉油揮發(fā)性成分α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片進含量測定，為企業(yè)生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品提供參考。

1 材料

1.1 儀器GC-2030氣相色譜儀(日本島津)、HP-INNDWAX以聚乙二醇20000(PEG-20M)為固定相的毛細管柱；XPE105電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥材、藥品與試劑河南宛艾、河北祁艾、湖北蘄艾、安徽霍山艾葉、江西樟樹艾葉，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)科董誠明教授鑒定均為菊科植物艾的干燥葉，使用時粉碎使通過二號至三號篩，混合均勻，備用。萘(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20151204)；α-蒎烯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：897-200001，100%)；1,8桉葉素對照品(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號：AF8011518，99.48%)；β-側(cè)柏酮對照品(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號：S24A8T42373，99.1%)；樟腦對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110747-201409，98.7%)；反式石竹烯對照品(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號：AF8051849，94.2%)；冰片對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110743-200905，98.0%)。15個廠家艾葉油樣品：江西泰城天然香料有限公司，批號：20170903；廣州雪松天然藥用油有限公司，批號：20180102；江西森科香料有限公司，批號：20171112；江西省吉水縣天成香料油廠，批號：20171203；江西百草藥業(yè)有限公司，批號：20170301；江西環(huán)球天然香料有限公司，批號：T20180120；江西寶林天然香料有限公司，批號：20170728；江西匯通藥用香料油有限公司，批號：20180615；江西眾源香料有限公司，批號20180724；廣州日化化工有限公司，批號：S20170523；廣州寶士迪香精香料有限公司，批號：20180601；深圳市鼎誠植物香料有限公司，批號：20171107；深圳國鑫，批號：20170124；廣州晶晶生物科技有限公司，批號：20180701；吉安博銳香料油有限公司，批號：20171206(均為水蒸氣蒸餾法提取，可編號為01～15)及5個艾葉主產(chǎn)區(qū)自制艾葉油樣品(可編號為16～20)共20個樣品。乙酸乙酯(天津市富宇精細化工有限公司)；蒸餾水(自制)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

2 氣相色譜法測定艾葉油中揮發(fā)性成分的含量方法

2.1 色譜條件用以聚乙二醇(PEG-20M)為固定相的毛細管柱(30 m×0.32 mm,0.5 m)，柱溫采用程序升溫,起始溫度為80℃,維持8 min后,以2℃/min升溫至100℃,保持8 min,以5℃/min升溫至200℃,保持10 min,以10℃/min升溫至220℃,保持8 min。進樣口溫度為250℃,檢測器溫度為250℃,分流比為1∶20。理論塔板數(shù)按萘峰計算應(yīng)不低于10000[9～12]。

2.2 供試品及對照品的制備自制艾葉油樣品的制備：參照《中華人民共和國藥典》2015版四部揮發(fā)油測定法(甲法)，取粉碎的艾葉約100 g，精密稱定，置于2000 ml圓底燒瓶中，加入1200 ml蒸餾水，浸泡4 h后按水蒸汽蒸餾法加熱提取?；亓? h后，分出揮發(fā)油，備用[13，14]。內(nèi)標溶液的制備：取萘適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成1 ml含5 mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標溶液。供試品及對照品的制備：分別取各供試品溶液100 mg，精密稱定，置10 ml容量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液2 ml，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為供式品溶液；另精密稱取α蒎烯對照品、1,8-桉葉素對照品、β-側(cè)柏酮對照品、樟腦對照品、反式石竹烯對照品、冰片對照品各10 mg,置于10 ml量瓶中,精密加入內(nèi)標溶液2 ml,加乙酸乙酯稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 校正因子的測定取混合對照品溶液1 μl注入氣相色譜儀，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，計算α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片的校正因子分別為0.793、1.295、1.433、1.584、1.128、1.206。

2.3.2 線性關(guān)系考察精密稱定α-蒎烯40 mg、1,8桉葉素100 mg、β-側(cè)柏酮100 mg、樟腦40 mg、反式石竹烯60 mg、冰片80 mg至20 ml容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，作為儲備溶液。分別取儲備溶液10 ml、5 ml、1 ml、0.5 ml、0.1 ml、0.05 ml至100 ml容量瓶中，加內(nèi)標溶液20 ml，加乙酸乙酯稀釋至刻度。按上述色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品的濃度為橫坐標(X)，以對照品的濃度為縱坐標(Y)進行線性回歸，α-蒎烯的回歸方程為Y=1241820X+1654.1，r=0.9998；1,8桉葉素的回歸方程為Y=993299X+4137.4，r=0.9996；β-側(cè)柏酮的回歸方程為Y=903734X+1942.1，r=0.9999；樟腦的回歸方程為Y=863590X-289.5，r=0.9998；反式石竹烯的回歸方程為Y=1191187X-278.9， r=0.9998；冰片的回歸方程為Y=1028108X+1287.2，r=0.9993。結(jié)果表明α-蒎烯0.001～0.2 mg/ml，1,8桉葉素0.5～0.0025 mg/ml，β-側(cè)柏酮0.5～0.0025 mg/ml，樟腦0.2～0.001 mg/ml，反式石竹烯0.3～0.0015 mg/ml，冰片0.4～0.002 mg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度實驗精密吸取上述混合對照品1μl,按上述色譜條件測定，連續(xù)進樣5次，記錄α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片的峰面積，計算RSD%，結(jié)果為0.25%、0.23%、0.63%、0.85%、1.81%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性實驗取同一樣品(19號樣品)6份，按上述供試品制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片峰的面積，計算RSD，結(jié)果為0.51%、0.42%、0.77%、0.34%、0.67%、0.13%，表明本法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗取重復(fù)性項下第1份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h按上述色譜條件測定,記錄α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片的峰面積，計算RSD，結(jié)果分別為1.66%、0.47%、1.67%、0.37%、1.03%、0.52%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率實驗取已知含量的同一樣品(19號樣品)6份分別精密加入一定量α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片對照品，按上述色譜條件測定各組分的含量，并計算α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片平均回收率及RSD值，結(jié)果表明上述方法準確可行。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

注: 按上述方法分別精密吸取混合對照品和供試品溶液各1μl注入氣相色譜儀，測定，即得

3 結(jié)果

3.1 樣品性狀不論是市售還是自制大部分艾葉油都是黃綠色，質(zhì)地清稀，具有艾草香。其中市售和自制艾葉油色澤同為藍綠色的樣品，統(tǒng)一具有刺鼻氣味。自制艾葉油質(zhì)地都皆是清稀，市售艾葉油質(zhì)地則不盡相同。見表2。

表2 不同樣品性狀對比結(jié)果

3.2 不同樣品揮發(fā)性成分占比自制艾葉油與市售艾葉油所含α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片的含量差別較大。另不同主產(chǎn)區(qū)的自制艾葉油之間和不同廠家的市售艾葉油之間成分含量也有很大差距。其中市售艾葉油中05、08、10號為未檢測到β-側(cè)柏酮，主產(chǎn)區(qū)艾葉其中河北和安徽艾葉含量較高；對于石竹烯類成分，樣品中05、09、10、11號含量較高；1,8桉葉素含量控制，市售14號含量最高，將近46%百分含量，此廠家艾葉油可進一步研究。各主廠區(qū)艾葉均相對較高其中蘄艾含量最高；市售艾葉油中01號和12號含量較低。見表3。

3.3 不同樣品氣相色譜見圖1～圖20。

表3 不同樣品各揮發(fā)性成分的百分含量

圖1 01號樣品氣相色譜圖

圖2 02號樣品氣相色譜圖

圖3 03號樣品氣相色譜圖

圖4 04號樣品氣相色譜圖

圖5 05號樣品氣相色譜圖

圖6 06號樣品氣相色譜圖

圖7 07號樣品氣相色譜圖

圖8 08號樣品氣相色譜圖

圖9 09號樣品氣相色譜圖

圖10 10號樣品氣相色譜圖

圖11 11號樣品氣相色譜圖

圖12 12號樣品氣相色譜圖

圖13 13號樣品氣相色譜圖

圖14 14號樣品氣相色譜圖

圖15 15號樣品氣相色譜圖

圖16 16號樣品氣相色譜圖

圖17 17號樣品氣相色譜圖

圖18 18號樣品氣相色譜圖

圖19 19號樣品氣相色譜圖

4 討論

本課題首次對不同廠家的市售艾葉油進行了性狀及揮發(fā)性成分含量的對比，選取了有毒物質(zhì)β-側(cè)柏酮，有效抗炎物質(zhì)石竹烯類成分，參照2015版《中華人民共和國藥典》一部對艾葉主成分1,8桉葉素的含量控制3個重要成分對市售艾葉油的質(zhì)量做一個初步了解。不同樣品之間α-蒎烯、冰片的含量跨度較大，而樟腦的含量所有樣品都相對較低，說明了市售艾葉油與自制艾葉油橫向與縱向之間皆有差異。

根據(jù)實驗結(jié)果分析：艾葉油中市售和自制色澤同為藍綠色的樣品，統(tǒng)一具有刺鼻氣味，據(jù)文獻了解艾葉油呈現(xiàn)藍綠色是由于倍半萜類成分，結(jié)構(gòu)母核為奧類的倍半萜有交叉共軛體系，所以顯藍色。期間也對市售艾葉油做了揮發(fā)性實驗，分別于1 h、5 h、8 h、24 h進行觀察，24 h后均有殘留痕跡，08號揮發(fā)性比較明顯，24 h后仍有殘留痕跡，其次是11號、06號、10號及14號樣品，02號、03號、15號較不明顯，說明了市售艾葉油中除了揮發(fā)性成分還有其他油脂性成分存在的可能性，而自制艾葉油則均有較好的揮發(fā)性。就色譜圖來看，01號、02號、12號、13號市售艾葉油揮發(fā)性化學(xué)成分相對較多，其他則揮發(fā)性化學(xué)成分的種類較少，自制艾葉油則有相對多的不同物質(zhì)，原因可能是該色譜分析方法對其中的一部分樣品不適用、也可能是樣品中本身就揮發(fā)性化學(xué)成分相對少。

自制艾葉油與市售艾葉油所含α-蒎烯、1,8桉葉素、β-側(cè)柏酮、樟腦、反式石竹烯、冰片的含量差別較大。據(jù)研究表明β-側(cè)柏酮[15]是有毒性的一類成分，樣品05、08、10號為未檢測到β-側(cè)柏酮，推測原因其一是艾葉原藥材來源，其二生產(chǎn)廠家對成品艾葉油做了相應(yīng)的減毒處理。其中河南和湖北艾葉β-側(cè)柏酮含量較低，說明艾葉油不同成分含量及質(zhì)量與艾葉生長環(huán)境、采收時間、干燥方式、儲藏方式、儲存時間、都有一定關(guān)系，對于含有抗菌、消炎的石竹烯類[16]成分，樣品中05、09、10、11號含量較高，參照2015版《中華人民共和國國藥典》一部對艾葉主成分1,8桉葉素含量控制，市售艾葉油14號含量為45.848%，較為突出，各主產(chǎn)區(qū)蘄艾含量最高，符合公認的蘄艾為道地藥材。綜上，總體來說市售艾葉油及自制艾葉油質(zhì)量參差不齊，通過有毒物質(zhì)、有效物質(zhì)及《藥典》控制成分分析比較優(yōu)選出10號、16號、19號樣品進一步探討。由于不同產(chǎn)區(qū)艾葉產(chǎn)量不同，價格、質(zhì)量也不同，所以自制艾葉油成本也值得進一步探討。同樣不同廠家的艾葉油質(zhì)量價格也不盡相同；不同廠家的市售艾葉油質(zhì)量價格也不盡相同；是選擇市售艾葉油還是自制艾葉油也是需要生產(chǎn)企業(yè)后期更深入的探討；生產(chǎn)企業(yè)自身生產(chǎn)條件、生產(chǎn)艾葉油相關(guān)產(chǎn)品的類型、市售和自制艾葉油的成本對比都是需要考慮的重要因素，在艾葉油選擇過程中，需要生產(chǎn)企業(yè)后期更深入的探討。