多指標(biāo)聯(lián)合檢測在診斷結(jié)核性腦膜炎中的臨床價值

許 茜，董 軻，李 鸞，姜南艷，張惠中

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院/唐都醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710038)

結(jié)核性腦膜炎(TBM)是一種嚴(yán)重的肺外結(jié)核癥，致殘率及致死率較高，目前早期檢測手段有限，易誤診、誤治導(dǎo)致病情加重[1]。腦脊液結(jié)核桿菌DNA(TB-DNA)和腦脊液腺苷脫氨酶(ADA)檢測是臨床用于診斷TBM的常用實驗室檢查方法，而結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(T-SPOT.TB)是近幾年興起的一種將免疫學(xué)和細(xì)菌學(xué)方法相結(jié)合的檢測技術(shù)，越來越廣泛地應(yīng)用于臨床。但有關(guān)于此三項檢測指標(biāo)聯(lián)合檢測的報道較少，本研究選取84例TBM患者多項實驗室檢查指標(biāo)進(jìn)行回顧性分析，以比較單項檢測與聯(lián)合檢測的異同，進(jìn)一步探討其應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的170例臨床資料比較完備的腦膜炎患者臨床資料，收集入院時三項檢測指標(biāo)的結(jié)果，對其進(jìn)行回顧性分析。其中，84例TBM患者作為試驗組，男52例，女32例，年齡14～76歲，平均(36.8±15.9)歲；86例非TBM患者(58例病毒性腦膜炎、22例化膿性腦膜炎、6例隱球菌腦膜炎)作為對照組，男56例，女30例，年齡12～79歲，平均(40.1±16.4)歲，性別和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)[2]：(1)腦脊液培養(yǎng)或抗酸桿菌涂片查見結(jié)核桿菌或皮膚結(jié)核菌素試驗陽性；(2)有結(jié)核病史或腦外活動性結(jié)核病灶；(3)有腦膜炎臨床表現(xiàn)，細(xì)菌和真菌培養(yǎng)無陽性結(jié)果，墨汁染色和革蘭染色陰性；(4)顱腦影像學(xué)符合結(jié)核性腦膜炎特征；(5)抗結(jié)核治療有效；(6)腦脊液糖和氯化物降低和蛋白定量升高。以上標(biāo)準(zhǔn)需全部滿足。

1.2主要方法

1.2.1腦脊液ADA檢測 標(biāo)本以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液采用速率法進(jìn)行ADA檢測，試劑購自中國科華生物科技股份有限公司；儀器采用全自動生化分析儀，購自美國貝克曼庫爾特公司，型號AU5800。ADA大于7.5 U/L為診斷TBM的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2腦脊液TB-DNA檢測 TB-DNA檢測采用實時熒光定量PCR方法，試劑購自中國湖南圣湘生物科技有限公司；儀器采用實時熒光定量PCR擴(kuò)增儀，購自美國ABI公司，型號7500。

1.2.3血漿T-SPOT.TB檢測 采用微生物學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的方法嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。(1)從肝素抗凝的外周血分離出單個核細(xì)胞并進(jìn)行洗滌和計數(shù)制成標(biāo)準(zhǔn)懸液，將細(xì)胞懸液和抗原在適宜條件下培養(yǎng)過夜后洗滌加入酶標(biāo)和底物反應(yīng)液，最后斑點(diǎn)計數(shù)。(2)結(jié)果判讀：嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行結(jié)果分析。T-SPOT.TB診斷試劑盒購自英國Oxford Immunotec公司。

1.2.4腦脊液抗酸染色 嚴(yán)格按照《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》進(jìn)行，取3～5 mL腦脊液離心留沉渣進(jìn)行涂片、固定、染色，鏡下查找結(jié)核桿菌并計數(shù)。試劑購自中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司，儀器采用Olympus CX21光學(xué)顯微鏡。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS18.0軟件，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，計量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TB-DNA、ADA、T-SPOT.TB和抗酸染色在2組中的結(jié)果比較 在各檢測方法TB-DNA、ADA、T-SPOT.TB和抗酸染色對診斷TBM的單項檢測的陽性率中，試驗組均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TB-DNA、ADA、T-SPOT.TB和抗酸染色陽性率分別為33.3%(28/84)、65.5%(55/84)、75.0%(63/84)、10.7%(9/84)，陽性率以T-SPOT.TB方法最高，抗酸染色最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者四種檢測方法陽性率比較

2.2抗酸染色、ADA、TB-DNA和T-SPOT.TB在兩組中的診斷性能 以臨床最終診斷確定為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計算抗酸染色、ADA、TB-DNA和T-SPOT.TB的靈敏度、特異度、陽性及陰性預(yù)測值、正確率和約登指數(shù)。四種方法中，靈敏度和陰性預(yù)測值依次升高，以T-SPOT.TB最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；特異度和陽性預(yù)測值依次遞減，以TB-DNA和抗酸染色最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；正確率和約登指數(shù)以ADA最高；抗酸染色和TB-DNA兩種方法比較，特異度和陽性預(yù)測值相同，而靈敏度、陰性預(yù)測值、正確率和約登指數(shù)后者均高于前者，并且9例抗酸染色陽性者均被TB-DNA陽性者所包含，顯示出抗酸染色診斷性能不如TB-DNA。見表2。

表2 抗酸染色、TB-DNA、ADA和T-SPOT.TB對診斷TBM的診斷效果(%)

2.3TB-DNA、ADA和T-SPOT.TB單項和聯(lián)合檢測對診斷TBM的價值 把TB-DNA(a)、ADA(b)和T-SPOT.TB(c)三種檢測方法分別進(jìn)行兩兩組合或三者聯(lián)合計算出診斷效能。結(jié)果顯示：(1)在靈敏度方面，a+b+c聯(lián)合模式相比較a+b和a+c聯(lián)合模式大大提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但相比較b+c聯(lián)合模式差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(2)在特異度方面，a+b+c聯(lián)合模式相比較a+c和b+c聯(lián)合模式差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明特異度降低不明顯；(3)在陽性預(yù)測值和正確率方面，a+b+c聯(lián)合模式相比較三種兩兩組合差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(4)a+b+c聯(lián)合模式相比較b+c聯(lián)合模式，在診斷效能方面雖有所提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 ADA、TB-DNA和T-SPOT.TB三項指標(biāo)在診斷TBM的聯(lián)合分析(%)

注：a、b、c分別代表TB-DNA、ADA和T-SPOT.TB檢測；分別與a+b、a+c、b+c 3種聯(lián)合模式比較，*P>0.05；-表示此項無數(shù)據(jù)

3 討 論

TBM有“三個最”：是最常見的肺外結(jié)核??；是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病；是結(jié)核病中最嚴(yán)重的病型[3]。激素和抗菌藥物的不規(guī)范使用使得TBM的癥狀、體征及多項檢查結(jié)果表現(xiàn)不典型[4]，加上病原學(xué)診斷的相對滯后和低檢出率，造成誤診率、病殘率和病死率較高[5-6]。因此早期診斷為TBM的重中之重。

ADA作為嘌呤核苷酸代謝的一種關(guān)鍵酶，與T淋巴細(xì)胞的活化密切相關(guān)。它參與了結(jié)核性腦膜炎的病理生理過程，導(dǎo)致在腦脊液中的活性增高[7]。本次研究中，ADA的陽性率為64.9%，特異度為75.0%，顯著高于對照組，符合國外學(xué)者CHO等[8]觀點(diǎn)。有報道顯示，腦脊液ADA檢測不僅可用于TBM的早期診斷，還可用于病情和療效觀察[9]。但也有報道指出，ADA作為T淋巴細(xì)胞的活化的一種標(biāo)志物，其升高亦可見于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦膜淋巴瘤，結(jié)節(jié)病，蛛網(wǎng)膜下腔出血等，另外一些患者由于其免疫力較弱(如白血病、AIDS等)，即使患有TBM，ADA濃度和陽性率也比較低[10]。因此ADA對診斷TBM雖有相對較高的靈敏度和特異度，但其活性高低直接與機(jī)體免疫情況有關(guān)，只能間接反映結(jié)核感染。

TB-DNA檢測具有取材多樣、用量少、用時短、費(fèi)用低的特點(diǎn)，還能大大提高L型結(jié)核菌的檢出率[11]。和涂片法比較，二者均具有高特異性，而陽性率分別為33.3%(28/84)和10.7%(9/84)，TB-DNA檢測是涂片法的3.1倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。分析原因為：(1)涂片法無法檢出L型結(jié)核菌，這也說明TB-DNA提高的陽性率其中大部分為L型結(jié)核菌；(2)標(biāo)本中因含菌量太少，傳統(tǒng)方法無法檢出；(3)抗酸染色過程中，腦脊液沉渣膜不易固定，沖洗時較易出現(xiàn)部分剝脫的現(xiàn)象。雖然TB-DNA有較高的特異度，但其靈敏度相比較ADA和T-SPOT.TB仍然較低。分析原因為：(1)抗結(jié)核治療使腦脊液中TB-DNA降到最低檢出限以下；(2)血腦屏障的保護(hù)作用使得結(jié)核桿菌釋放到腦脊液中的菌量較少[12]。并且從表3中可以看出a+b+c模式相比較a+c模式，在各項診斷效能方面雖均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但因其高特異性(100.0%)，大大減少了誤診率(0.0%)，相比較ADA和T-SPOT.TB，TB-DNA對確診TBM仍然具有不可替代的作用。

T-SPOT.TB檢測是最近幾年興起的一種微生物學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的方法，具有標(biāo)本易取、高陽性率、耗時短的特點(diǎn)。此外，可檢測的標(biāo)本類型多種多樣，靜脈血、腦脊液、心包液、胸腹水等均獲適用，操作簡便[13]。另外，該方法所用到的兩種刺激性抗原(ESAT-6和CFP-10)均具結(jié)核桿菌特異性，不存在于絕大部分非結(jié)核桿菌和所有卡介苗中，因此T-SPOT.TB檢測可以很好地鑒別診斷絕大部分非結(jié)核桿菌感染者和接種卡介苗者[14]。在本次研究中，T-SPOT.TB檢測在診斷效能方面靈敏度最高(75.0%)，漏診率最低(25.0%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但特異度和陽性預(yù)測值最低，與張秀英等[15]的報道相符，相比較陸建紅等[16]報道偏低。因此，筆者認(rèn)為，T-SPOT.TB檢測對于TBM的初篩具有較好的臨床價值，一旦陽性能夠提示臨床醫(yī)生TBM的可能，進(jìn)而進(jìn)行針對性的檢查，減少漏診。但T-SPOT.TB檢測收費(fèi)較高且不能對結(jié)核感染的陳舊期、潛伏期和活動期進(jìn)行有效區(qū)分，對于結(jié)核發(fā)病率高且貧困的地區(qū)，限制了該檢測的優(yōu)勢。盡管如此，當(dāng)臨床特征和其他實驗室指標(biāo)低于預(yù)先設(shè)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)時，T-SPOT.TB還是展現(xiàn)了較好的應(yīng)用價值[17-18]。

在聯(lián)合檢測中，三者聯(lián)合相比較兩兩組合和單獨(dú)檢測，能將TBM的靈敏度和陰性預(yù)測值分別提高至95.2%和92.2%，漏診率和陰性似然比分別降至4.8%和0.1%，在強(qiáng)調(diào)TBM的早診早治方面，不失為一種良好的組合模式。TBM作為一種肺外結(jié)核的重癥神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，由于早期臨床表現(xiàn)不典型，病原學(xué)檢出率低，影像學(xué)檢查不特異。因此，在其診斷過程中，要在臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及是否合并顱外結(jié)核的基礎(chǔ)上，結(jié)合ADA、TB-DNA和T-SPOT.TB檢測，必要時應(yīng)將三者聯(lián)合檢測以提高結(jié)核性腦膜炎的檢出率。

4 結(jié) 論

在TBM的鑒別診斷中，任一單項指標(biāo)的診斷效能均低于三者，單純通過一項指標(biāo)進(jìn)行診斷均顯不妥，ADA、TB-DNA和T-SPOT.TB聯(lián)合檢測大大提高了靈敏度，減少了漏診率，且創(chuàng)傷小、簡便易行，尤其在一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)和結(jié)核高負(fù)擔(dān)的地區(qū)，能較大程度地減少誤診誤治，利于結(jié)核疫情控制。