哈 瑞,李 剛,師志云,武 濤,趙志軍,賈 偉△
(1.寧夏醫(yī)科大學,寧夏銀川 750004;寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院:2.醫(yī)學檢驗中心; 3.預防保健科,寧夏銀川 750004;4.寧夏病原微生物重點實驗室,寧夏銀川 750004)
銅綠假單胞菌為條件致病菌,亦是醫(yī)院感染的主要病原菌之一[1]。亞胺培南屬于碳青霉烯類藥物中常用的一種,近年來,耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌引起的感染不斷增多,本研究初步對其耐藥機制進行了探討,旨在為臨床合理使用抗菌藥物治療銅綠假單胞菌的感染提供較有價值的依據(jù)。
1.1菌株 隨機挑選寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院2016年1月至2017年9月各類臨床標本中分離的對亞胺培南耐藥的非重復銅綠假單胞菌80株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853。
1.2儀器與試劑 VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及其配套鑒定卡購自法國梅里埃公司;K-B法藥敏紙片及分配器、M-H藥敏平板、PCR擴增儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司;PCR反應試劑2×Power Taq PCR MasterMix購自中國北京百泰克生物技術有限公司;DL2000 Marker購自中國北京全式金生物技術有限公司;合成的引物購自中國上海生物工程股份有限公司。
1.3方法
1.3.1細菌鑒定及藥敏試驗 保存菌株室溫復蘇后轉(zhuǎn)種培養(yǎng)18~24 h,K-B紙片擴散法測定其對抗菌藥物的敏感性。實驗方法及藥敏結(jié)果判斷參照2016年美國臨床和實驗室標準協(xié)會操作規(guī)程進行。
1.3.2PCR引物設計 本次試驗所要檢測的耐藥基因引物均參照國內(nèi)外文獻設計[2-7],所有PCR擴增所需的引物都委托中國上海生物工程有限公司合成。見表1。
表1 靶基因的引物序列
1.3.3耐藥基因檢測 采用煮沸法提取模板DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR反應采用50 μL體系,PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性35 s,適宜溫度退火35 s,72 ℃延伸1 min,重復30個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用含GoldViewⅠ型核酸染色劑的1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析(電壓80 V,時間35 min),凝膠成像。
1.4統(tǒng)計學處理 采用WHONET5.6軟件進行耐藥性分析。
2.1臨床特征 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌的科室分布以神經(jīng)外科(28.0%)、ICU(16.0%)、呼吸內(nèi)科(15.0%)所占比例較高。標本類型以呼吸道標本為主,占86.0%。見表2、3。
表2 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌主要科室分布
表3 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌的標本分布
2.2藥敏試驗結(jié)果 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌對阿米卡星的耐藥率最低(7.5%),對復方磺胺甲噁唑的耐藥率最高(97.5%)。見表4。
表4 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌藥敏試驗結(jié)果(%)
續(xù)表4 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌藥敏試驗結(jié)果(%)
2.3耐藥基因檢測結(jié)果 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中,blaVIM基因陽性1株(1.2%),blaOXA-10基因陽性4株(5.0%),其他耐藥基因均未檢出。膜孔蛋白OprD2缺失67株(83.8%)。見表5、圖1。
表5 80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥基因檢測結(jié)果
注:M表示DNA標準帶;1表示blaVIM基因的擴增條帶;2表示blaOXA-10基因的擴增條帶;3表示膜孔蛋白OprD2基因的擴增條帶;4表示膜孔蛋白OprD2基因缺失;5表示空白對照
圖1耐藥基因PCR結(jié)果
亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物是對多種β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定的、非典型的一類β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,具有強大的殺菌活性,常作為治療銅綠假單胞菌感染的最后防線。然而近年來隨著此類抗菌藥物的不規(guī)范使用,耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌不斷增多,且呈現(xiàn)一定比例的多重耐藥性[8],給臨床治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。
銅綠假單胞菌的醫(yī)院科室分布廣泛,而且具有集中于部分科室的趨勢,該院以神經(jīng)外科(28.0%)、ICU(16.0%)送檢標本的耐亞胺培南銅綠假單胞菌檢出率較高,有別于巫俊琴等[9]報道的呼吸內(nèi)科檢出率最高,可能因為該院這2個科室標本送檢率高,患者住院時間長,病情危重且抵抗力低下,較多呈昏迷狀態(tài),常需使用器械性和侵入性治療手段維持生命體征。80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌主要分離自呼吸道標本(86.0%),與陳燕等[10]、張曉蘭等[11]的報道基本一致,呼吸道本身有定植銅綠假單胞菌,而住院患者呼吸道分泌功能減退,纖毛活動減弱,分泌物增加,機體免疫力降低,更容易受銅綠假單胞菌侵襲,這二者共同導致呼吸道標本中銅綠假單胞菌檢出率較高。
本研究藥敏結(jié)果顯示,耐亞胺培南銅綠假單胞菌對阿米卡星的耐藥率最低,為7.5%,與2017年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測報道基本一致[12]。對其他兩種氨基糖苷類藥物妥布霉素和慶大霉素的耐藥率也較低,可能是因為其具有耳毒性和腎毒性,而且單獨用于治療銅綠假單胞菌感染往往失敗,故臨床一般不單獨使用;對復方磺胺甲噁唑及氨曲南耐藥性較強,耐藥率分別為97.5%、48.7%,高于巫俊琴等[9]報道的67.0%和26.0%,可能與該院臨床較多使用此類藥物有關;對常用的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物哌拉西林、頭孢他啶、頭孢吡肟的耐藥率分別為22.5%、26.2%、21.2%,與高世華等[13]所報道的較一致,說明該院對常規(guī)使用的抗菌藥物敏感性較好,可能與該院臨床醫(yī)師規(guī)范使用抗菌藥物,醫(yī)院嚴格進行藥物監(jiān)管措施等有關。該院耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌呈現(xiàn)一定的多重耐藥,但程度相對較輕,建議治療此類細菌感染考慮聯(lián)合用藥,如β-內(nèi)酰胺類+氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類+喹諾酮類、喹諾酮類+氨基糖苷類或雙β-內(nèi)酰胺類?;诒狙芯康慕Y(jié)果,頭孢吡肟聯(lián)合阿米卡星可以用于絕大多數(shù)銅綠假單胞菌感染的治療。
銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制復雜多樣,主要包括:(1)碳青霉烯酶的產(chǎn)生,能水解碳青霉烯類藥物,導致出現(xiàn)耐藥[14]。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的主要碳青霉烯酶是B類金屬酶(MBL)及D類苯唑西林水解酶(OXA類酶)。目前在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的MBL主要有6種基因型:blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaSIM、blaSPM、blaGIM,OXA類酶基因主要包括blaOXA-10、blaOXA-14、blaOXA-23等。該院耐藥基因檢測結(jié)果顯示,80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中,blaVIM基因陽性1株(1.2%),blaOXA-10基因陽性4株(5.0%),其他耐藥基因均未檢出,提示產(chǎn)生碳青霉烯酶不是本地區(qū)銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機制。(2)外膜通透性障礙,膜孔蛋白OprD的改變或缺失,使抗菌藥物進入細菌受阻而產(chǎn)生耐藥。OprD分為OprD1、OprD2、OprD3[15],其中OprD2孔道具有配體特異性,能形成亞胺培南的特異性結(jié)合位點,為亞胺培南進入細菌的的快速特異性通道[5],膜孔蛋白OprD2的缺失或表達降低是銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的重要機制。沈繼錄等[16]發(fā)現(xiàn)亞胺培南耐藥株的OprD2基因缺失率明顯高于敏感株。本研究中,膜孔蛋白OprD2基因缺失率為83.8%,表明膜孔蛋白OprD2基因缺失是導致該院銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要原因,與胡琴等[17]報道的72.0%較為一致,低于四川地區(qū)報道的100.0%[15],國外ARABESTANI等[18]也有報道耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中OprD2基因呈高表達,說明銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制存在地域差異,而且各地區(qū)耐藥的主要原因也不盡相同。根據(jù)本研究中的耐藥性統(tǒng)計分析,該院耐亞胺培南銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥不甚嚴重,推斷膜孔蛋白OprD2缺失主要介導銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥,對其他藥物的作用較小。本研究中,80株耐亞胺培南銅綠假單胞菌中,有72株檢測到碳青霉烯酶基因blaVIM、blaOXA-10,或者有膜孔蛋白OprD2基因的缺失,剩余8株耐藥菌可能由其他耐藥機制介導,銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制還有主動外排泵的過度表達、藥物作用靶位的改變、細菌生物膜的形成以及整合子的介導等,筆者會在后續(xù)研究中進一步闡明。
銅綠假單胞菌的耐藥性日趨嚴重,因此,臨床醫(yī)師應積極送檢微生物標本,嚴格參考藥敏結(jié)果,合理選用抗菌藥物,以減少細菌耐藥的發(fā)生。該院銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機制是膜孔蛋白OprD2的缺失,實驗室應重視此類蛋白的流行病學檢測,加強醫(yī)院感染控制。