MALDI-TOF MS用于耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析的研究*

徐建民，蔣 虔，楊 哲，李好蓮，姜 錚，宋世平，袁順宗，尹秀云，陳建魁

(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心/原解放軍第307醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100071)

越來(lái)越多碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株的出現(xiàn)使臨床針對(duì)感染治療的形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻[1]。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機(jī)制與細(xì)菌的生物被膜形成，外膜孔蛋白丟失合并β內(nèi)酰胺酶的過(guò)度表達(dá)，或菌株表達(dá)碳青霉烯酶相關(guān)[2-6]。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制[7]。該酶的編碼基因主要位于轉(zhuǎn)座子、整合子、質(zhì)粒等可移動(dòng)的基因單元上，從而導(dǎo)致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)可以通過(guò)垂直或水平方式快速出現(xiàn)及傳播[6]。臨床上治療CRKP感染的手段極其有限，一般只能采取患者隔離或?qū)ψ≡涵h(huán)境采取消毒等措施[8]。因此，快速準(zhǔn)確的對(duì)CRKP進(jìn)行同源性分析，及時(shí)有效的溯源對(duì)控制院內(nèi)感染尤為重要。

多位點(diǎn)序列分型(MLST)是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增管家基因片段并進(jìn)行序列分型，根據(jù)其序列型(ST)結(jié)果進(jìn)行同源性分析。可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)室間數(shù)據(jù)共享及比對(duì)，數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)便快捷、可比性強(qiáng)、能直接對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行分析[9]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)用于微生物快速鑒定是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，它是利用MALDI-Biotyper 3軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)對(duì)其進(jìn)行同源性分析，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室已得到較好地應(yīng)用[10]。

筆者以MLST分型方法獲得的同源性結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)[11]，對(duì)MALDI-TOF MS獲得的同源性分析結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，探索MALDI-TOF MS對(duì)耐藥肺炎克雷伯菌同源性分析在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的準(zhǔn)確性和可行性。

1 材料與方法

1.1CRKP菌株 菌株的來(lái)源分布、MLST分型引物序列、擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果處理方法，參照筆者前文[9]。

1.2方法 將95株CRKP接種于哥倫比亞血平皿上，放入溫度為35 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用滅菌竹簽挑取單個(gè)菌落，少量菌體均勻涂布在靶板孔位上，室溫下晾干。加1 μL 70%甲酸溶液均勻涂覆在樣本上，室溫下晾干。再加1 μL IVD HCCA基質(zhì)溶液均勻覆蓋在待測(cè)樣本上，室溫下晾干。將加樣完成的待測(cè)靶板放入MicroflexTM質(zhì)譜儀，進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。利用MicroflexTM質(zhì)譜儀配套軟件MALDI Biotyper RTC進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋峰圖譜的采集。結(jié)果評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：2.0分以下為匹配一般，2.0～<2.3分為匹配較好，2.3～3.0分為匹配好；并將蛋白質(zhì)指紋峰譜圖導(dǎo)入MALDI-Biotyper 3軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1指紋圖譜獲得 95株CRKP鑒定得分均超過(guò)2.3，結(jié)果為匹配好，表明獲得的蛋白指紋圖譜較完整，可以進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)表1。

表1 95株CRKP MALDI-TOF MS鑒定得分詳表

2.2質(zhì)譜聚類分析結(jié)果 首先通過(guò)MicroflexTM質(zhì)譜儀的分析軟件Flexanalysis獲得蛋白質(zhì)指紋峰信息，再將蛋白質(zhì)指紋峰譜圖導(dǎo)入MALDI-Biotyper 3軟件進(jìn)行聚類分析。從聚類分析圖中可發(fā)現(xiàn)：95株菌可分為Ⅰ、Ⅱ 2個(gè)大類，Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅱa、Ⅱb 五個(gè)亞類，95株CRKP聚類分析樹(shù)狀圖中，可以直觀的發(fā)現(xiàn)Ⅰ類中Ⅰb和Ⅰc亞類親緣關(guān)系較近，Ⅰa亞類與Ⅰb、Ⅰc亞類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；Ⅱ類中Ⅱa和Ⅱb亞類親緣關(guān)系較近。見(jiàn)圖1。

圖1 95株CRKP蛋白峰聚類分析圖

表2 MLST、MALDI-TOF MS結(jié)果與來(lái)源科室分布

注：其余為Q1、Q3、Q6～8、Q12～17、Q19～20、Z1～23、Z25～31、N1～30、I1～17

2.3質(zhì)譜聚類分析與MLST分型結(jié)果的比較 筆者之前的研究中[9]，MLST分型結(jié)果顯示：Q2號(hào)菌株為ST1型，Z24號(hào)菌株序列為ST15型，Q4為ST1198型，Q5為ST152型，Q9為ST1030型，Q10為ST2260型，Q11為ST1254型，Q18為ST2928型，另外87株CRKP的MLST分型均為ST11型。利用在線分析軟件eBURST V3對(duì)上述MLST結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果最終顯示ST2260和ST11為同一克隆型，ST1、ST15、ST152、ST1030、ST1198、ST1254、ST2928為單個(gè)型。證明其中88株菌株親緣關(guān)系近，另外7株菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究中，MALDI-TOF MS聚類分析結(jié)果卻將95株CRKP分為了2大類，5個(gè)亞類。與MLST結(jié)果相比較后，發(fā)現(xiàn)87株ST11型分布在各亞類中，Q4、Q5、Q9、Q11分布在Ⅱa；亞類中Q10、Q18分布在Ⅱb亞類中；Q2、Z24分布在Ⅰb亞類中。見(jiàn)表2。

3 討 論

MALDI-TOF MS 鑒定基于細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)峰的特征及豐度，通過(guò)分析待測(cè)菌體蛋白質(zhì)峰圖與模式菌蛋白質(zhì)峰圖之間的相似處，進(jìn)而得到鑒定結(jié)果[12]。蛋白質(zhì)由遺傳基因物質(zhì)決定，相對(duì)分子質(zhì)量較大，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，MALDI-TOF MS通過(guò)分析同菌種間的細(xì)微差異，可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步分型[13]。其實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速，可在幾分鐘內(nèi)通過(guò)MALDI-Biotyper 3獲得聚類分析及主成分圖。近來(lái)有國(guó)內(nèi)學(xué)者研究證明[14-17]，MALDI-TOF MS聚類分析可以對(duì)常見(jiàn)致病菌及耐藥菌進(jìn)行同源性分析。

國(guó)內(nèi)學(xué)者謝思[18]對(duì)53株CRKP進(jìn)行MLST和MALDI-TOF MS同源性分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法結(jié)果相近，學(xué)者認(rèn)為MALDI-TOF MS的結(jié)果比MLST結(jié)果能更詳細(xì)的展示各菌株之間的親緣關(guān)系。MENCACCI等[19]采用MALDI-TOF MS對(duì)35株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性分析，結(jié)果與重復(fù)序列PCR的分型結(jié)果基本相符，學(xué)者認(rèn)為在未獲得基因分型結(jié)果前，MALDI-TOF MS 可以用來(lái)對(duì)耐藥菌暴發(fā)感染的提前判斷。

筆者之前的研究中[11]，MLST分型結(jié)果顯示：Q10為ST2260型，Q2號(hào)菌株為ST1型，Z24號(hào)菌株序列為ST15型，Q5為ST152型，Q4為ST1198型，Q9為ST1030型，Q11為ST1254型，Q18為ST2928型，其余87株CRKP的MLST分型均為ST11型。eBURST V3對(duì)以上MLST結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，最終結(jié)果顯示ST2260和ST11為同一克隆型，ST1、ST15、ST152、ST1030、ST1198、ST1254、ST2928，7株為單個(gè)型。結(jié)果顯示1株ST2260和87株ST11，共88株菌株親緣關(guān)系近，另外7株菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而MALDI-TOF MS聚類分析結(jié)果卻將95株CRKP分為了兩大類，5個(gè)亞類，兩種方法結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，Q2、Z24分布在Ⅰb組中；Q4、Q5、Q9、Q11分布在Ⅱa組中；Q10、Q18分布在Ⅱb組中，其余87株ST11型各亞類中均有分布。

研究結(jié)果顯示，MicroflexTM質(zhì)譜儀聚類分析結(jié)果與MLST分型結(jié)果并不完全一致，原因分析：MLST的分型原理是從基因分子層面對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分析，雖然該方法檢測(cè)了7對(duì)管家基因，但對(duì)于分析含有大量基因組序列插入或缺少某些基因組序列詳細(xì)信息的菌株存在一定的局限性；MALDI-TOF MS聚類分析原理基于蛋白質(zhì)的表達(dá)及其表達(dá)豐度，然而臨床分離自CRKP受到抗菌藥物選擇壓力、感染位置、分離培養(yǎng)環(huán)境等因素的影響，其某些菌體蛋白可能過(guò)表達(dá)或不表達(dá)。使其蛋白峰圖產(chǎn)生差別，從而導(dǎo)致進(jìn)一步聚類分析時(shí)產(chǎn)生誤差。與國(guó)內(nèi)外部分學(xué)者的研究結(jié)果相比較，筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前者部分研究結(jié)果并不完全相符?？赡芘c研究中的標(biāo)本量比前者的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量更多，來(lái)源科室更多有關(guān)系。如此一來(lái)，MALDI-TOF在CRKP同源性分析方面的應(yīng)用還需要更深入的研究。SACHSE等[20]研究對(duì)比了MALDI-TOF、MLST及隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析三種同源性分析方法，結(jié)果顯示，三種方法之間結(jié)果并不完全一致。該學(xué)者認(rèn)為，MALDI-TOF MS應(yīng)用于臨床需要更多、更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，雖然MALDI-TOF MS聚類分析能夠?qū)?5株CRKP親緣關(guān)系顯示的比較直觀清晰，但是該方法廣泛應(yīng)用于臨床菌株同源性分析還需要更深入的實(shí)驗(yàn)研究。