鐵蛋白籠形納米顆粒應(yīng)用于HIV-1 P24抗原高靈敏檢測(cè)的研究*

張利沙，曾德軍

(1.德陽(yáng)市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川德陽(yáng) 618000；2.德陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所，四川德陽(yáng) 618000)

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在疾病的預(yù)防和診斷中發(fā)揮重要作用，特別是低豐度指標(biāo)的檢測(cè)具有重要價(jià)值。生物自組裝納米材料引入生物傳感系統(tǒng)并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，能夠?qū)崿F(xiàn)低豐度、高靈敏度的檢測(cè)[1-4]。鐵蛋白作為一種生物自組裝納米材料，操控性好，應(yīng)用于生物傳感系統(tǒng)具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 PCR儀、蛋白電泳裝置購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo Electron公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；核酸電泳儀購(gòu)自中國(guó)北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha公司；超聲細(xì)胞粉碎儀購(gòu)自美國(guó)Sonics公司；微孔板檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；超微量樣本分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；透視電子顯微鏡購(gòu)自日本日立公司，型號(hào)H7000。

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、dNTPs等均購(gòu)自日本Takara公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、核酸膠回收試劑盒等均購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司；所用抗體均購(gòu)自中國(guó)上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；蛋白質(zhì)Marker(Fermentas)、DNA Marker(TransGen Biotech)、BCA Protein Assay Kit(Pierce)、HIV-1 P24抗原酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒等均購(gòu)自中國(guó)上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司。

1.2引物與測(cè)序 DNA測(cè)序由中國(guó)華大基因測(cè)序公司完成，引物合成由中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司完成，見表1。

表1 引物序列

1.3菌種及質(zhì)粒 菌種：大腸桿菌DH5α作為目標(biāo)質(zhì)粒復(fù)制菌種；大腸桿菌BL21(DE3)作為目標(biāo)質(zhì)粒表達(dá)菌種；大腸桿菌BL21基因組DNA作為擴(kuò)增生物素連接酶基因序列(BirA)的模板。質(zhì)粒：pET28a-F-H-Chain作為擴(kuò)增鐵蛋白基因序列(rHF)的模板；pET28a作為承載耦聯(lián)生物素結(jié)合肽(BAP)的鐵蛋白基因序列原核表達(dá)質(zhì)粒載體；pCDFDuet作為承載BirA的原核表達(dá)質(zhì)粒載體。所用菌種和質(zhì)粒均來源于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4方法

1.4.1質(zhì)粒構(gòu)建 以pET28a-F-H-Chain為模板，分別以FF1、FF2、FF3為正向引物，以FR為反向引物，經(jīng)3次PCR擴(kuò)增出耦聯(lián)生物素結(jié)合肽的鐵蛋白基因序列BAP-linker-rHF，NcoⅠ/XhoⅠ酶切并插入pET28a，構(gòu)成pET28a-rHF-BAP；以大腸桿菌BL21(DE3)基因組為模板，BF、BR為正反向引物，PCR擴(kuò)增BirA，NcoⅠ/SalⅠ酶切并插入pCDFDuet，構(gòu)成pCDFDuet-BirA。

1.4.2生物素化鐵蛋白的表達(dá) pET28a-rHF-BAP、pCDFDuet-BirA共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得目標(biāo)工程菌，以終濃度1 mmol/L的異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，25 ℃，190 r/min，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h；以未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌為對(duì)照，全菌裂解液通過聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)觀察目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。

1.4.3生物素化鐵蛋白的純化和表征 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌經(jīng)超聲破碎，并以40%蔗糖為基質(zhì)，270 000 r/min超速離心4 h，上清透析去糖，獲得純化的生物素化鐵蛋白。分別針對(duì)鐵蛋白和生物素進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)驗(yàn)證分析；同時(shí)以2%，pH7的磷鎢酸負(fù)染，透視電子顯微鏡觀察自組裝結(jié)果，并用Image J圖像軟件分析處理。采用BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定提取純化的生物素化鐵蛋白濃度。

1.4.4生物素化鐵蛋白應(yīng)用于P24檢測(cè) 以5 μg/mL HIV-1 P24抗體包被酶標(biāo)板，并以0.5%脫脂奶粉封閉；按照ELISA操作步驟，分別依次加入10倍梯度稀釋的HIV-1 P24抗原(1 000～0.001 ng/mL)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，生物素化HIV-1 P24抗體，鏈霉親和素，生物素化鐵蛋白(24 μg/mL)，鏈霉親和素耦聯(lián)的辣根過氧化物酶；最后以現(xiàn)配TMB顯色，2 mol/L硫酸銨終止反應(yīng)，450 nm讀取吸光度；以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作線性回歸曲線，并與商業(yè)HIV-1 P24抗原ELISA試劑盒作對(duì)比。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)粒構(gòu)建 通過基因重組手段將597 bp的rHF-BAP基因片段插入到質(zhì)粒載體pET28a上，構(gòu)建出pET28a-rHF-BAP。將966 bp的BirA基因片段插入到質(zhì)粒載體pCDFDuet上，構(gòu)建出pCDFDuet-BirA原核生物表達(dá)載體。2個(gè)表達(dá)載體均經(jīng)限制性酶切和基因測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。

2.2生物素化鐵蛋白的表達(dá) pET28a-rHF-BAP、pCDFDuet-BirA共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得目標(biāo)工程菌。在IPTG的誘導(dǎo)作用下，全菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE顯示：在相對(duì)分子質(zhì)量25.0×103和35.0×103大小左右出現(xiàn)2條明顯蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量與耦聯(lián)生物素結(jié)合肽的鐵蛋白(23.5×103)和生物素連接酶(32.0×103)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小一致。見圖1。

2.3生物素化鐵蛋白的表征 對(duì)提取純化的生物素化鐵蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證分析顯示：針對(duì)鐵蛋白和生物素的蛋白印跡均在25.0×103左右處出現(xiàn)目標(biāo)印跡條帶，與耦聯(lián)生物素結(jié)合肽的鐵蛋白(23.5×103)相對(duì)分子質(zhì)量大小一致。透射電鏡觀察純化的生物素化鐵蛋白在體外自組裝的情況，發(fā)現(xiàn)提取純化的生物素化鐵蛋白懸液存在大量直徑為12 nm左右的顆粒狀規(guī)則結(jié)構(gòu)，與鐵蛋白籠形納米結(jié)構(gòu)一致。通過BCA法測(cè)定得出提取并純化的生物素化鐵蛋白原濃度為1.8 mg/mL。見圖2、3。

注：L1泳道為誘導(dǎo)后的工程菌裂解液電泳；L2泳道為未經(jīng)誘導(dǎo)工程菌裂解液電泳
圖1生物素化鐵蛋白誘導(dǎo)表達(dá)電泳結(jié)果

注：A表示針對(duì)鐵蛋白的免疫印跡試驗(yàn)；B表示針對(duì)生物素的免疫印跡試驗(yàn)
圖2免疫印跡試驗(yàn)驗(yàn)證生物素化鐵蛋白

圖3 生物素化鐵蛋白自組裝電鏡表征

2.4生物素化鐵蛋白應(yīng)用于P24檢測(cè) 將提取純化所得的生物素化鐵蛋白應(yīng)用于HIV-1 P24 抗原ELISA檢測(cè)中，與商業(yè)化HIV-1 P24 抗原ELISA檢測(cè)試劑盒相比較：按照cut-off=2.1×陰性對(duì)照，商業(yè)化HIV-1 P24 抗原ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)HIV-1 P24抗原的檢測(cè)下限為1 ng/mL，展示有生物素的鐵蛋白籠形納米顆粒作橋聯(lián)的ELISA檢測(cè)對(duì)HIV-1 P24抗原下限達(dá)到0.1 ng/mL，檢測(cè)下限提高10倍。見圖4。

圖4 生物素化鐵蛋白籠形納米顆粒應(yīng)用于P24 ELISA檢測(cè)

3 討 論

檢測(cè)技術(shù)的更新與發(fā)展，特別是對(duì)低豐度指標(biāo)的高靈敏檢測(cè)的開發(fā)能夠給臨床醫(yī)療提供依據(jù)和指導(dǎo)，例如HIV-1 P24抗原的高靈敏檢測(cè)能夠提高艾滋病早前期的檢出率，縮短檢測(cè)窗口期，為臨床診治提供指導(dǎo)[5-7]；同時(shí)低豐度、高靈敏度的檢測(cè)也深化和補(bǔ)充了目前醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)中的不足?；诩{米材料的各種特性，將納米材料引入到檢驗(yàn)技術(shù)中得到了很好的效果[8-9]，特別是容易通過基因工程改造的生物源性納米結(jié)構(gòu)，例如病毒顆粒，大部分病毒由單體衣殼蛋白組裝形成的規(guī)則結(jié)構(gòu)，通過單體分子修飾可在病毒顆粒上展示多分子的功能基團(tuán)，且這些新改造的病毒顆粒處于納米水平，應(yīng)用于生物傳感能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[10-12]。

鐵蛋白具有病毒衣殼蛋白的性質(zhì)，在體外能自組裝形成兩種納米結(jié)構(gòu)，即大鐵蛋白籠形納米顆粒由24個(gè)基本元件形成八面體對(duì)稱的中空結(jié)構(gòu)，外徑12 nm，小鐵蛋白籠形納米顆粒由12個(gè)基本元件形成四面體對(duì)稱的中空結(jié)構(gòu)[13]。以大鐵蛋白籠形納米顆粒為對(duì)象，通過分子生物學(xué)的手段對(duì)鐵蛋白單體進(jìn)行生物素化修飾，鐵蛋白單體自組裝時(shí)可將生物素展示于籠形納米顆粒上，1個(gè)納米顆?？烧故?4分子生物素，通過生物素與鏈霉親和素的特異性結(jié)合，檢測(cè)信號(hào)被放大，提高了檢測(cè)相對(duì)靈敏度。經(jīng)過驗(yàn)證，將生物素化鐵蛋白應(yīng)用到HIV-1 P24抗原ELISA的檢測(cè)當(dāng)中，與商業(yè)化HIV-1 P24抗原ELISA試劑盒檢測(cè)比較，檢測(cè)下限有明顯提高，可以用于檢測(cè)低豐度的分析指標(biāo)。

鐵蛋白籠形納米顆粒上功能性分子展示不僅僅局限于生物素，也可以將檢測(cè)相關(guān)聯(lián)的某種或多種分子展示于鐵蛋白籠形納米顆粒上，構(gòu)建出單功能或多功能的鐵蛋白籠形納米顆粒[14-15]，實(shí)現(xiàn)其特定的檢測(cè)指標(biāo)的高靈敏甚至超靈敏檢測(cè)。

4 結(jié) 論

通過基因工程技術(shù)，采用分子生物學(xué)的手段，成功構(gòu)建生物素化鐵蛋白單體，并在體外自組裝形成表面展示有多分子生物素的鐵蛋白籠形納米顆粒。以HIV-1 P24抗原檢測(cè)為例，將其應(yīng)用到ELISA檢測(cè)中，與商業(yè)化的HIV-1 P24抗原ELISA試劑盒檢測(cè)相比，成功實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的放大，具有相對(duì)較高的檢測(cè)靈敏度，可用于檢測(cè)相對(duì)豐度較低的分析指標(biāo)。