酸棗仁藥材UPLC指紋圖譜研究

雷橋仕， 魏梅， 孫冬梅， 梁慧， 童培珍， 王燕雄， 官永河

（廣東一方制藥有限公司，廣東佛山528244）

酸棗仁是鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子[1]，主要分布在我國遼寧、河北、河南、山東、山西等地區(qū)。中醫(yī)臨床常以酸棗仁為君藥組方治療虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴等癥。研究表明，酸棗仁含有皂苷類、黃酮類、生物堿、脂肪酸、氨基酸、酸棗多糖及微量元素[2，3]，具有鎮(zhèn)靜、催眠、降壓、降血脂等多種藥理作用[4-6]。由于其良好的療效及廣泛的臨床應(yīng)用，市場需求量增大、價(jià)格上漲，導(dǎo)致出現(xiàn)偽品及摻偽品。目前，酸棗仁藥材甄偽鑒別主要依賴于性狀、顯微及薄層色譜鑒別，而理?xiàng)椚噬珴少|(zhì)地與酸棗仁極為相似，且有學(xué)者認(rèn)為理?xiàng)椚室嗪兴釛椚实闹饕行С煞諿7，8]，帶來了甄別上的困難，故急需在指紋圖譜技術(shù)指導(dǎo)下開展全成分質(zhì)量控制研究。文獻(xiàn)報(bào)道酸棗仁指紋圖譜研究主要為高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測器（HPLCELSD）指紋圖譜以及部分低波長高效液相色譜—紫外分光光度（HPLC-UV）指紋圖譜[9，10]，其雖然分析信息全面，但是檢測信號(hào)基線漂移嚴(yán)重，容易丟失峰信息且精密度較差。因此，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法進(jìn)行酸棗仁指紋圖譜研究，建立更快速、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好的方法，以期為酸棗仁藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)的新方法，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀（美國Waters公司，PDA檢測器），Empower 3.0色譜工作站。Waters ACQUITYUPLCTMI-Class型超高效液相色譜儀；沃特世超高效液相飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（Xevo G2-XSQ-TOFMS），UNIFI 1.8工作站（英國曼徹斯特Waters公司）；ME204E萬分之一分析天平、XP26百萬分之一分析天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-QDirect超純水系統(tǒng)（美國默克股份有限公司）。

1.2 試劑 乙腈（默克股份有限公司，色譜純）；甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）；水為超純水；斯皮諾素（批號(hào)：B221711108，含量：98%，中國食品藥品檢定研究院）；木蘭花堿（批號(hào)：150813，含量：≥98%，成都普菲德生物科技有限公司）。

1.3 試藥 酸棗仁藥材S1～S18為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，理?xiàng)椚仕幉腖19～L23為鼠李科植物滇刺棗zizyphuomauritsana Lam.的干燥成熟種子，見表1。酸棗仁對照藥材（批號(hào)：121517～201604，中國食品藥品檢定研究院），經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定。

表1 酸棗仁及理?xiàng)椚仕幉漠a(chǎn)地信息Table 1 Information of habitats of Semen Ziziphi Spinosae and Semen ZiziphiMauritianae sam p les

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜及質(zhì)譜參數(shù)

2.1.1 UPLC條件 色譜柱為Waters Cortecs T3（100mm×2.1mm，1.6μm）。以乙腈（A）—0.05%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～7min，3%～15%A；7～10min，15%～17%A；10～15min，17%～17%A；15～20 min，17%～25%A；20～25 min，25%～90%A。柱溫：35℃；檢測器：PDA；檢測波長：254 nm；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣體積：1μL。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù) 氮?dú)庾鳛橘|(zhì)譜離子源的霧化、錐孔氣；電噴霧電離正離子模式；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；錐孔電壓：40 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；掃描時(shí)間：0.5 s；掃描時(shí)間間隔：0.02 s；質(zhì)荷比范圍：50∶1 200；數(shù)據(jù)采集模式：ESI（+/-）下采集MSE；以甲酸鈉溶液校正質(zhì)量軸，以亮氨酸腦啡肽（leucine-enkephalin）為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)量精度，錐孔氣體流量：50 L/h。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取斯皮諾素、木蘭花堿對照品適量，用甲醇配制成每1mL含斯皮諾素20μg、木蘭花堿15μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取酸棗仁藥材粉末（過65目篩）1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇20mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取60min，放冷。再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的液相色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）均＜3%，相對峰面積sR均＜5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份，“2.1”項(xiàng)下的液相色譜條件進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時(shí)間sR均＜3%，相對峰面積sR均＜5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的液相色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜。結(jié)果顯示，各色譜峰的相對保留時(shí)間sR均＜3%，相對峰面積sR均＜4%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 酸棗仁色譜峰的液相色譜—質(zhì)譜（LC-MS）鑒定 酸棗仁及理?xiàng)椚仕幉牡闹讣y圖譜比較見圖1。本研究按擬定的液相色譜及質(zhì)譜條件，通過對照品比較和UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)共鑒定了藥材中的9個(gè)色譜峰，包括了3個(gè)生物堿類和6個(gè)黃酮類成分，其中峰7、峰8分別為R型或S型的N-glcindoleacectic Acid，峰9為木蘭花堿，峰12為Isospinosin，峰13為斯皮諾素，峰20為6'''-pcoumaloylspinosin，峰21為6'''-feruloylspinosin，峰22、峰23分別為R型或S型6''-O-（3-glc-indoleacetyl）spinosin。見表2。由于斯皮諾素色譜峰的保留時(shí)間適中且分離度良好，并且是酸棗仁主要的活性成分，所以確定以斯皮諾素為參照峰（S），計(jì)算其它色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積。19批酸棗仁藥材和5批理?xiàng)椚仕幉牡南鄬Ψ迕娣e結(jié)果見表3。

圖1 酸棗仁、理?xiàng)椚屎退釛椚蕦φ账幉牡腢PLC指紋圖譜比較Figure 1 Com parison of the UPLC finger-prints of Semen ZiziphiSpinosae，Semen ZiziphiMauritianae and reference sam ple of Semen ZiziphiSpinosae

表2 相關(guān)色譜峰的指認(rèn)[12，13]Table 2 Identification of the related chromatographic peaks

2.5.2 酸棗仁藥材及理?xiàng)椚实腢PLC指紋圖譜相似度分析 由圖1可知酸棗仁與理?xiàng)椚仕幉牡闹讣y圖譜較為相似，說明酸棗仁與理?xiàng)椚实幕瘜W(xué)成分較為相似，與文獻(xiàn)報(bào)道的較為相似[7，8]。因此，需要進(jìn)一步對酸棗仁與理?xiàng)椚蔬M(jìn)行鑒別。將收集于不同產(chǎn)地的18批酸棗仁藥材和5批理?xiàng)椚仕幉臉悠返腢PLC指紋譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件，以酸棗仁對照藥材為參照圖譜并計(jì)算24批藥材的相似度。結(jié)果顯示酸棗仁藥材的相似度較高，均大于0.97，而理?xiàng)椚仕幉牡南嗨贫容^低，均小于0.90。見表4。

2.5.3 酸棗仁及理?xiàng)椚实腢PLC指紋圖譜聚類分析及主成分分析 將收集于不同產(chǎn)地的18批酸棗仁和5批理?xiàng)椚仕幉臉悠返南鄬Ψ迕娣e導(dǎo)入IBM SPSSStatistics 19.0軟件進(jìn)行聚類分析及主成分分析。聚類分析結(jié)果顯示，24批樣品可明顯分為2大類，見圖2-A。山西、河北、山東、遼寧等產(chǎn)地的酸棗仁藥材聚成一大類，且產(chǎn)地差異不明顯，對照藥材與山西運(yùn)城的S1樣品聚為一小類，推測山西運(yùn)城的酸棗仁藥材質(zhì)量優(yōu)于其他產(chǎn)地。此外，收集于不同地區(qū)的理?xiàng)椚仕幉木蹫橐活?，說明理?xiàng)椚仕幉馁|(zhì)量的相似性，可能均為同一個(gè)品種或來源于同一個(gè)產(chǎn)地。另外，編號(hào)為S8的酸棗仁與理?xiàng)椚示蹫橐淮箢?，推測S8批次酸棗仁藥材可能為偽品或者摻偽品。PCA得分圖見圖2-B，可以發(fā)現(xiàn)24批樣品主要分為2組，來自道地產(chǎn)區(qū)的酸棗仁分為Ⅰ組，理?xiàng)椚史譃棰蚪M，因此主成分分析能夠有效區(qū)分酸棗仁與理?xiàng)椚?，與相關(guān)研究結(jié)論較為相似[11]。另外編號(hào)為S8、S10兩批酸棗仁的分布介于酸棗仁與理?xiàng)椚手g，可以推測S8、S10為偽品或者摻偽品，與聚類分析結(jié)果互為一致。結(jié)果表明，聚類分析和主成分分析能夠明顯區(qū)分酸棗仁和理?xiàng)椚剩⑶疫€可以推測部分酸棗仁為偽品或者摻偽品。

2.5.4 酸棗仁藥材的UPLC指紋圖譜建立 結(jié)合前期相似度分析、聚類分析及主成分分析結(jié)果，排除推測為摻偽品的2批樣品和對照藥材后，將第Ⅰ組16批樣品的酸棗仁UPLC色譜圖依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件，建立酸棗仁藥材的對照指紋圖譜，結(jié)果顯示酸棗仁藥材具有26個(gè)共有峰。見圖3、4。

表3 19批酸棗仁藥材和5批理?xiàng)椚仕幉牡南鄬Ψ迕娣eTable 3 The related peak area of 19 batches of Semen ZiziphiSpinosae sam p les and 5 batches of Semen Ziziphi Mauritianae sam ples

表4 19批酸棗仁和5批理?xiàng)椚实南嗨贫冉Y(jié)果Table 4 Sim ilarity of19 batches of Semen Ziziphi Spinosae sam ples and 5 batches of Semen Ziziphi Mauritianae sam p les

圖2 不同產(chǎn)地酸棗仁和理?xiàng)椚实木垲惙治鰣D（A）和PCA得分圖（B）Figure 2 The cluster analysis（A）and principal com ponentanalysis（B）results of Semen Ziziphi Spinosae samp les and Semen ZiziphiMauritianae sam p les from differenthabitats

圖3 16批不同產(chǎn)地酸棗仁藥材UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 3 The overlaying graph of UPLC finger-printof 16 batches of Semen ZiziphiSpinosae sam p les from differenthabitats

圖4 酸棗仁藥材UPLC對照指紋圖譜Figure 4 The reference UPLC finger-printof16 batches of Semen ZiziphiSpinosae samples from differenthabitats

3 討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)對酸棗仁藥材進(jìn)行了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇及70%乙醇等溶劑考察，結(jié)果以70%甲醇提取色譜峰數(shù)目較多、峰形較好且溶劑效應(yīng)較小，故本研究選擇70%甲醇為溶劑。結(jié)合文獻(xiàn)研究，前期實(shí)驗(yàn)選取了204、335、254 nm等波長進(jìn)行對比研究，結(jié)果204 nm波長下的色譜圖基線漂移，335 nm波長下的峰信息較少，以波長為254 nm的色譜圖基線平穩(wěn)且峰信息容量較大，故本研究選擇254 nm波長。另外，本研究選取了乙腈—水、乙腈—0.05%乙酸、乙腈—0.05%甲酸等流動(dòng)相進(jìn)行對比，結(jié)果顯示以乙腈—水為流動(dòng)相的色譜圖部分色譜峰拖尾嚴(yán)重，以乙腈—0.05%甲酸為流動(dòng)相的色譜圖分離效果最佳。

酸棗仁道地產(chǎn)區(qū)或主要產(chǎn)區(qū)主要為冀、魯、晉、陜等地。由于酸棗仁的用量較大，市場價(jià)格持續(xù)上漲，漸漸出現(xiàn)以理?xiàng)椚侍娲釛椚实默F(xiàn)象。理?xiàng)椚蕿椤吨腥A人民共和國藥典》酸棗仁項(xiàng)下未收錄的品種，是市場用量較小、價(jià)格便宜的地方習(xí)用品。其外觀與酸棗仁相似，主成分差別不大。本研究通過相似度評價(jià)、聚類分析和主成分分析表明，采集于不同地方的理?xiàng)椚逝c酸棗仁的區(qū)別明顯，凸顯出來不同基源的品種差異性，為鑒定酸棗仁的真?zhèn)翁峁┝丝茖W(xué)依據(jù)。另外，來自不同道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)酸棗仁的相似度較高，說明酸棗仁藥材質(zhì)量總體差異不大，可為企業(yè)選址購買藥材及指導(dǎo)GAP建設(shè)提供科學(xué)性的建議。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸棗仁藥材UPLC指紋圖譜具有26個(gè)共有峰，以LC-MS鑒定了其中的9個(gè)色譜峰，包括3個(gè)生物堿類和6個(gè)黃酮類成分，各批次酸棗仁藥材所含成分基本一致，相似度極高。本研究建立了能快速評價(jià)酸棗仁質(zhì)量的UPLC指紋圖譜方法，可為酸棗仁藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)的新方法。