• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    益氣解毒方藥干預致病菌入侵后腸上皮細胞自噬基因miR130a/ATG16L1的表達

    2019-11-14 00:40:00樊冬梅索娜劉潔明任寶琦
    廣州中醫(yī)藥大學學報 2019年12期
    關鍵詞:物組無藥反義

    樊冬梅, 索娜, 劉潔明, 任寶琦

    (1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣東廣州510405;2.廣州市番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院消化科,廣東廣州510006;3.廣州中醫(yī)藥大學2018級碩士研究生,廣東廣州510006;4.廣東省中醫(yī)院,廣東廣州510021)

    炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD)是原因不明的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩?。–rohn’s disease,CD)。IBD病程遷延,反復發(fā)作,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[1,2]。近年來,某些致病菌尤其是侵襲性大腸桿菌(adherent-invasive E.coli,AIEC)的入侵導致的腸上皮細胞(EICs)自噬功能障礙致胞內(nèi)細菌清除不足,進而引起啟動炎癥反應通路激活,是腸道黏膜受損、炎癥反復發(fā)作的關鍵機制[3-7]。研究表明Atg16L1、Atg5等與IBD的發(fā)病密切相關,是控制自噬介導的炎癥反應的重要自噬基因,其介導的腸上皮細胞自噬功能異常是IBD腸道炎癥啟動及復燃的關鍵[7,8]。感染AIEC后IECs通過上調(diào)miR-30c/130a表達、下調(diào)自噬基因Atg5、Atg16L1的表達引起細胞自噬功能下降而致胞內(nèi)致病菌清除不足[3-6]。因此,如何能維持適度的EICs自噬功能從而有效清除IBD相關致病菌對于IBD的預防、治療和轉(zhuǎn)歸極為重要。目前國內(nèi)許多學者主張益氣解毒法用于防治IBD的復發(fā)[9,10]。廣東省名中醫(yī)勞紹賢教授就是將本法成功用于IBD防治,臨床療效確切[11-13]。我們前期研究證實以此法為主的復方干預治療IBD可有效預防復發(fā)[11],腸炎靈片作為醫(yī)院的院內(nèi)制劑應用于防治IBD的臨床中取得了較好的療效,有著廣闊的應用前景。本研究進一步從干預致病菌入侵后腸上皮細胞自噬基因miR130a/ATG16L1表達的角度,探討益氣解毒方藥防治IBD的新途徑,為其進一步的臨床推廣提供理論依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 細胞與細菌HCT116細胞株,來自中國科學院細胞庫。福氏志賀菌GIM1.539標準菌株購自廣州微生物研究所。

    1.2 動物SPF級SD大鼠及SPF級鼠料,均購自廣東省實驗動物中心,動物質(zhì)量合格證號:0602237。

    1.3 藥物及制備 益氣解毒方組成:黨參15 g,白術15 g,茯苓15 g,黃連10 g,救必應30 g,白花蛇舌草30 g,烏藥30 g,炙甘草5 g。上述藥材飲片由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗中心藥理研究室鑒定并制成3 g·mL-1的中藥湯劑。

    1.4 試劑與儀器DMEM高糖、雙抗、體積分數(shù)10%胎牛血清、胰酶(上海立菲生物技術有限公司);ATG16L1抗體、二抗(美國Sigma公司);總蛋白提取試劑盒(廣州市杏海生物科技有限公司);Trizol、PCRMix Taq、溴乙錠(北京艾德萊公司);miR130a模擬物及反義模擬物(美國Sigma公司);熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司);瓊脂糖、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)、RNAiso Plus(日本TAKARA公司);GAPDH引物序列上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’;ATG16L1上游5’-GAGCTGCTCCCGTGATGACT-3’,下游5’-CGCCACGTAACTGCCATCAG-3’;miR130a上游5’-AGGCCGCAGTGCAATGTT-3’,下游5’-GTGCAG GGTCCGAGGT-3’;引物合成,于上海生工生物工程有限公司完成。3K30型臺式高速冷凍離心機(美國Sigma公司);D1008低速離心機梯度(美國Scilogex公司);D-8721PCR儀(杭州晶格公司);NanoDrop2000超微量核酸蛋白檢測儀(美國Thermo Scientific公司);CFX96熒光定量PCR儀、imark酶標儀、2211BR Trans-Blot(SD Cell轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDocTMXRS+成像儀(美國Bio-Rad公司);TS-1脫色搖床(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)。

    1.5 實驗方法

    1.5.1 HCT116細胞株的培養(yǎng)和傳代 以1∶9比例(體積分數(shù))配制的含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中加入雙抗(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL)。獲得細胞后,棄上清液,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后棄上清液。加入2.5 g/L胰酶消化3min,輕輕吹打細胞致完全脫落,立即加入含血清的培養(yǎng)液形成細胞懸液。1 000 r/min離心5min后棄上清液,加入新鮮完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻細胞,后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿,做好標記。于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞2 d。待HCT116細胞貼壁生長至80%以上棄掉培養(yǎng)基進行傳代,根據(jù)細胞狀態(tài)可1傳2。

    1.5.2 中藥含藥血清制備 按照3 g·mL-1生藥濃度制取中藥湯劑原液,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠飼養(yǎng)1周后開始灌胃,每只大鼠每天早9點、晚4點各灌胃1次,每次1.5mL,對照組灌服等量生理鹽水。自由進食水,及時補充鼠料。連續(xù)給藥7 d,第7天灌藥前禁食12 h。末次給藥2 h后,無菌環(huán)境下乙醚麻醉大鼠,采用腹主動脈采血法收集大鼠全血,靜置30min,血液以3 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15min,用0.22μm微孔濾膜無菌分離血清,56℃水浴,30min滅活,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5.3 miR130a轉(zhuǎn)染及沉默轉(zhuǎn)染 使用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,將細胞鋪在24孔板中,使用脂質(zhì)體2000將熒光素酶報告載體同50 nmol/LmiR130a模擬物或相應的陰性對照物共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后,按照熒光強度與陰性對照組對照判斷轉(zhuǎn)染是否有效。以上述步驟中合成的目的片段為目的基因的反義基因作為miR130a反義模擬物進行沉默轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染都使用脂質(zhì)體2000,含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,將細胞鋪在24孔板中,使用脂質(zhì)體2000將熒光素酶報告載體同50 nmol/L miR130a反義模擬物或相應的陰性對照物共轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后,按照熒光強度與陰性對照組對照判斷轉(zhuǎn)染是否有效。

    1.5.4 福氏志賀菌GIM1.539標準菌株感染HCT116細胞模型的建立 福氏志賀菌GIM1.539標準菌株液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期,離心收集細菌,用無抗生素DMEM高糖培養(yǎng)基制備細菌懸液,通過測定吸光度[D(600 nm)]值調(diào)整細菌濃度[1D(600 nm)=1×108CFU/mL]。以含體積分數(shù)10%小牛血清的DMEM高糖(青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL)為完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)HCT116細胞株培養(yǎng)2 d。待HCT116細胞貼壁生長至80%時,棄掉培養(yǎng)基。按照感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI,MOI=細菌數(shù)∶細胞數(shù))為100∶1加入GIM1.539懸液,37℃、體積分數(shù)5%CO2的條件下共培養(yǎng)。入侵分析方法為在沒有抗生素的培養(yǎng)基孵化3 h,PBS沖洗細胞,含有100μg/mL慶大霉素在指定時間被加入培養(yǎng)基中,細胞被用1%Triton X-100溶解在脫離子水中,樣品持續(xù)稀釋并固定在瓊膠上,細菌的數(shù)量通過計數(shù)菌落形成單位(CFU)來確定。

    1.5.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測HCT116細胞中ATG16L1、LC3的蛋白表達 將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中,1 000 r/min離心10min,再用預冷PBS,1 000 r/min離心5min洗2次去除培養(yǎng)液。在每毫升冷裂解緩沖液中加入5μL磷酸酶抑制劑,1μL蛋白酶抑制劑和5μL PMSF(濃度200 mmol/L,溶于異丙醇),混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。在離心管的細胞中加入上述配制好的冷裂解緩沖液,5×106個細胞,加入量約為0.4mL,冰上操作,細胞與冷裂解緩沖液一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中,置于4℃搖床平臺上;溫和振蕩15min,14 000 r/min,4℃離心15min,取上清為全蛋白提取物,蛋白定量后,分裝保存于-70℃,避免反復凍融。按照試劑盒說明繪制標準曲線測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜,20 g/L白蛋白4℃封閉過夜后,依次加入一抗,4℃過夜,棄去一抗加入相對應的二抗,ECL顯色,曝光、顯影、定影、拍照、掃描后通過BandScan軟件進行條帶灰度半定量分析,以GAPDH為內(nèi)參。

    1.5.6 熒光定量聚合酶聯(lián)反應(PCR)法檢測HCT116細胞中miR130a、ATG16L1的RNA表達 以6×105/孔接種至6孔板中的細胞處理6 h后,以PBS漂洗細胞3次。每孔加入1mL Trizol,按照Trizol說明書提取總RNA。從-80℃冰箱中取出樣品RNA,于4℃解凍,然后在0.2mL PCR管中配制反應溶液,37℃、42℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應)進行cDNA的合成,SYBRGreen PCR,將PCR管置于定量PCR儀中進行反應。

    1.5.7 實驗分組 體外GIM1.539感染HCT116細胞模型建立后,根據(jù)添加的血清不同、干擾方案的不同分組,每次實驗每組設6個復孔。具體分組見表1。

    表1 細胞實驗分組Table 1 The grouping in the cell test

    1.6 統(tǒng)計方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,首先對每組數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性分析。樣本例數(shù)較小(n=6),對于組內(nèi)差異比較,若服從正態(tài)分布且方差齊性,則選用單因素方差分析;對于組間差異比較,若服從正態(tài)分布且方差齊性,采用獨立樣本t檢驗,否則選用秩和檢驗。檢驗結(jié)果以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Western Blot法檢測HCT116細胞中ATG16L1、LC3的蛋白含量 各組細胞轉(zhuǎn)染成功并接受干預完成后,用Western Blot法檢測各組細胞內(nèi)的ATG16L1、LC3蛋白含量水平,電泳結(jié)果見圖1、2,其灰度值結(jié)果見表2、表3。結(jié)果顯示:含藥血清干預方式與無藥血清干預方式miR130a模擬物組ATG16L1、LC3蛋白含量均較空白轉(zhuǎn)染組明顯減少(P<0.05);含藥血清干預方式與無藥血清干預方式miR130a反義模擬物組ATG16L1、LC3蛋白含量較空白轉(zhuǎn)染組均明顯增多(P<0.05);含藥血清干預方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的ATG16L1、LC3蛋白含量均較同組無藥血清干預方式的含量多(P<0.05)。除此之外,無論何種干預方式,miR130a模擬物或反義模擬物的陰性對照物組的ATG16L1、LC3蛋白含量均與空白轉(zhuǎn)染組無明顯差異。

    2.2 熒光定量PCR法檢測HCT116細胞中miR130a、ATG16L1的基因表達2組細胞轉(zhuǎn)染成功并接受干預完成后,用熒光定量PCR法檢測各組細胞中的miR130a、ATG16L1的基因表達水平,結(jié)果見表4、5。結(jié)果顯示:含藥血清與無藥血清干預方式miR130a模擬物組分別與本組空白轉(zhuǎn)染組比較,miR130a模擬物組miR130a的基因表達明顯上升(P<0.05),而ATG16L1的基因表達明顯下降(P<0.05);含藥血清與無藥血清干預方式miR130a反義模擬物分別與本組空白轉(zhuǎn)染組比較,miR130a反義模擬物組miR130a的基因表達明顯下降(P<0.05),ATG16L1的基因表達明顯上升(P<0.05);而含藥血清干預方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的miR130a基因表達均較同組無藥血清干預方式的下降(P<0.05),而ATG16L1基因表達均較同組無藥血清干預方式的上升(P<0.05)。

    圖1 含藥血清干預的HCT116細胞中ATG16L1、LC3蛋白表達Figure 1 The protein expression of ATG16L1 and LC3 in HCT116 cells intervened by drug-containing serum

    圖2 無藥血清干預的HCT116細胞中ATG16L1、LC3蛋白表達Figure 2 The protein expression of ATG16L1 and LC3 in HCT116 cells intervened by drug-free serum

    表2 2種不同干預方式下各組HCT116細胞ATG16L1蛋白含量比較Table 2 Comparison of the protein content of ATG16L1 in HCT116 cells of various groups after2 types of intervention(,n=6)

    表2 2種不同干預方式下各組HCT116細胞ATG16L1蛋白含量比較Table 2 Comparison of the protein content of ATG16L1 in HCT116 cells of various groups after2 types of intervention(,n=6)

    ①P<0.05,含藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較;②P<0.05,無藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

    組別 含藥血清 無藥血清F值P值空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組0.67±0.07 0.70±0.07 0.30±0.05①0.73±0.08 1.67±0.03①0.16±0.02 0.24±0.01 0.09±0.01②0.17±0.02 0.53±0.01②322.461 253.241 95.266 286.560 7 120.496 P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001

    表3 2種干預方式下各組HCT116細胞LC3蛋白含量比較Table 3 Com parison of the protein contentof LC3 in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention(,n=6)

    表3 2種干預方式下各組HCT116細胞LC3蛋白含量比較Table 3 Com parison of the protein contentof LC3 in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention(,n=6)

    ①P<0.05,含藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較;②P<0.05,無藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

    組別空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組含藥血清0.71±0.07 0.77±0.07 0.29±0.05①0.76±0.09 1.81±0.04①無藥血清0.24±0.18 0.30±0.14 0.13±0.10②0.27±0.25 0.75±0.04②F值29.000 45.980 10.476 16.329 25.081 P值P<0.001 P<0.001 P=0.009 P=0.002 P=0.001

    表4 2種干預方式下各組HCT116細胞m iR130a的基因表達比較Table 4 Com parison of the gene expression ofm iR130a in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention(,n=6)

    表4 2種干預方式下各組HCT116細胞m iR130a的基因表達比較Table 4 Com parison of the gene expression ofm iR130a in HCT116 cells ofvarious groups after2 types of intervention(,n=6)

    ①P<0.05,含藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較;②P<0.05,無藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

    組別空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組含藥血清0.85±0.02 0.87±0.02 3.26±0.03①0.99±0.06 0.23±0.01①無藥血清1.06±0.05 1.03±0.04 4.06±0.11②1.21±0.07 0.29±0.02②F值97.872 93.223 274.140 34.210 32.066 P值P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001

    表5 2種干預方式下各組HCT116細胞ATG16L1的基因表達比較Table 5 Com parison of the gene expression of ATG16L1 in HCT116 cells ofvarious groups after 2 types of intervention(,n=6)

    表5 2種干預方式下各組HCT116細胞ATG16L1的基因表達比較Table 5 Com parison of the gene expression of ATG16L1 in HCT116 cells ofvarious groups after 2 types of intervention(,n=6)

    ①P<0.05,含藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較;②P<0.05,無藥血清干預方式中與空白轉(zhuǎn)染組比較

    組別 含藥血清 無藥血清F值P值空白轉(zhuǎn)染組miR130a模擬物對照物組miR130a模擬物組miR130a反義模擬物對照物組miR130a反義模擬物組1.01±0.03 1.02±0.03 0.38±0.02①1.05±0.03 2.67±0.06①0.83±0.02 0.84±0.02 0.24±0.02②0.86±0.03 2.36±0.06②144.733 146.727 112.371 106.803 76.570 P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001 P<0.001

    3 討論

    某些致病菌尤其是AIEC入侵導致的腸道穩(wěn)態(tài)及免疫系統(tǒng)平衡被打破是腸道黏膜受損、炎癥反復發(fā)作的關鍵機制[2]。充分的證據(jù)顯示IBD患者腸道微生態(tài)紊亂,表現(xiàn)為潛在的有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌、厚壁菌數(shù)量的下降以及假定的致病菌如擬桿菌屬、大腸埃希桿菌數(shù)量的上升,并證實了在IBD患者回腸末端黏膜附著大量AIEC,能接近及入侵人IECs,導致IECs自噬能力下降,細菌復制,促使炎癥激活,不僅在IBD急性期,也是緩解期導致炎癥復發(fā)的主要因素。因此,IBD致病菌感染相關性細胞自噬功能障礙與IBD發(fā)病密切相關[3-6]。志賀菌屬又稱痢疾桿菌,是重要的侵襲性大腸桿菌之一[14]。目前國際上有采用志賀菌作為入侵菌進行入侵IECs探討IBD發(fā)生機制的研究[5,6,8],因此,本研究采用志賀菌作為入侵菌進行研究。

    自噬是真核生物普遍存在的自穩(wěn)機制,在胚胎發(fā)育、細胞自我保護和生存等過程中發(fā)揮關鍵作用。自噬參與胞內(nèi)微生物感染具有雙重作用:一方面,自噬能夠降解入侵的微生物,即以異源吞噬的方式清除胞內(nèi)的病原體;另一方面,有些微生物如IBD某些致病微生物能夠抑制細胞自噬而利于自身存活導致炎癥反應。人類全基因組關聯(lián)研究揭示,ATG和其他已知影響自噬過程的基因中的微小單核苷酸多態(tài)性位點,與克隆氏病的易感性有相關性[7]。ATG16L1在自噬小體形成中發(fā)揮關鍵作用,遺傳刪除ATG16L1能損害自噬小體的形成以及蛋白通過自噬途徑的清除,而且還導致TLR激動劑誘導的巨噬細胞促炎因子分泌的增強[15],葡聚糖硫酸鈉誘導的結(jié)腸炎加重[16],ATG16L1基因表達在EICs和潘氏細胞,其基因突變誘導亦導致不能有效清除腸道細菌感染,引起腸黏膜炎癥啟動[17,18]。LC3是酵母自噬相關蛋白ATG8的哺乳動物同源基因,LC3翻譯后經(jīng)修飾形成主要位于胞漿中的LC3-Ⅰ,自噬發(fā)生時,LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合,定位于自噬體膜上,即LC3-Ⅱ。它在自噬小體的延伸和閉合過程中均發(fā)揮重要功能,其作為自噬體膜的重要組分,對于自噬的產(chǎn)生和檢測起著不可替代的作用。對于LC3調(diào)控的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄翻譯后的修飾水平,有研究發(fā)現(xiàn)IBD致病菌所致IECs自噬障礙通路可檢測到LC3的表達調(diào)控異常[4]。因此,也作為本研究評價細胞自噬功能指標之一。目前細胞自噬對IBD炎癥啟動的潛在作用已經(jīng)越來越明朗,細胞自噬與抗感染免疫密切相關,病原體導致的細胞自噬障礙是誘發(fā)炎癥反應和炎癥性疾病的一個重要因素。新的研究已經(jīng)證明IBD相關病原體介導的自噬缺陷、病原體清除障礙和IBD發(fā)病機制之間存在相關性[4,5]。ATG介導的細胞自噬可清除降解細胞內(nèi)受損傷的細胞結(jié)構(gòu)以及細胞內(nèi)細菌感染等,是重要的自噬蛋白。許多研究表明致病菌感染相關IBD自噬異??赡芘c自噬蛋白調(diào)控缺陷有關,但其深入的機制可能與調(diào)控自噬的相關miRNAs有關[4,5,19]。最新研究[4,5,19]顯示,IBD相關致病菌AIEC感染后可通過上調(diào)miR130a表達下調(diào)自噬基因ATG16L1的表達,引起細胞自噬功能下降。靶基因預測發(fā)現(xiàn)ATG16L1基因存在miR130a的靶點。即miR130a可與靶ATG16L1基因的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合,引起其降解或抑制其蛋白翻譯,推測miR130a可能通過該機制下調(diào)ATG16L1基因表達從而影響細胞自噬。

    本研究通過對福氏志賀菌GIM1.539入侵HCT116人結(jié)腸癌上皮細胞模型進行miR130a模擬物、miR130a反義模擬物轉(zhuǎn)染,即miR130a過表達和沉默轉(zhuǎn)染,檢測細胞ATG16L1的蛋白含量以及基因表達,并與空白轉(zhuǎn)染組對照,同時分別對應進行miR130a模擬物陰性對照物和miR130a反義模擬物陰性對照物轉(zhuǎn)染作為參照,證實自噬基因ATG16L1表達受miR130a調(diào)控。當細胞內(nèi)miR130a模擬物含量增多時,抑制ATG16L1基因表達,生產(chǎn)該蛋白的量減少,稱為過表達;而當細胞內(nèi)miR130a反義模擬物增多時,競爭性地與胞內(nèi)miR130a結(jié)合,從而使ATG16L1得到更多表達,稱為沉默。同樣原理,通過同時檢測細胞內(nèi)LC3自噬蛋白含量,結(jié)果顯示miR130a過表達時,LC3蛋白含量亦隨之減少;miR130a沉默時,LC3蛋白含量隨之增加。雖然LC3蛋白調(diào)控機制在本課題中未作深入研究,但是當miR130a過表達時,ATG16L1、LC3含量均減少,足以證實自噬小體的形成必然受阻,從而表明miRNAs/ATG網(wǎng)絡調(diào)控是影響細胞自噬的重要機制。

    IBD病因復雜,被世界衛(wèi)生組織列為難治性疾病。2006年中醫(yī)消化病診療指南將本病劃歸中醫(yī)“痢疾”“腸澼”“腹痛”“便血”范疇。多數(shù)醫(yī)家[9,10]認為,IBD是在脾胃虛弱的基礎上感受寒、熱、濕毒之邪,傷于飲食勞倦或情志,致熱、濕、痰等邪客于腸道,阻滯氣血,腸絡失和,脂膜受損而發(fā)病。脾胃虛弱、運化失常是IBD發(fā)病過程中的內(nèi)在共性。鑒于此,國內(nèi)許多學者提出氣虛毒邪內(nèi)伏是IBD病情反復及復發(fā)的病機關鍵,并指出氣虛尤其脾氣虛是毒邪內(nèi)伏難以去除的主要原因,而毒邪多由風寒暑濕燥火侵犯人體后,深伏其中,纏綿不去,導致毒邪稽留,暗耗正氣,每于正氣虛弱或其他誘因觸發(fā),屢發(fā)屢重,纏綿難愈,因此在治療上主張“益氣解毒為主”是IBD的防治大法[9,10]。中醫(yī)毒邪類似于致病菌,但IBD致病菌入侵后單純用清熱解毒方法治療效果卻不明顯,因此類致病菌可導致細胞自噬功能障礙,細菌清除不足,毒邪反復侵襲留存于體內(nèi)促使炎癥啟動及復發(fā)。那么,益氣解毒防治IBD復發(fā)的有效機制可能是干預細胞自噬障礙維持適度的細胞自噬功能促使毒邪(致病菌)外出,與中醫(yī)益氣促使毒邪外出理論不謀而合。自噬的自我調(diào)控功能與中醫(yī)“氣”相通。自噬的自我調(diào)控是有一定條件的,當細胞受到不良環(huán)境的刺激,通過激發(fā)一系列信號因子(目前科學界認為與miRNAs/Atg調(diào)控網(wǎng)絡有關)對自噬進行調(diào)控,這與中醫(yī)氣的推動和調(diào)控功能相似。中醫(yī)認為氣虛則動力不足、功能低下,氣盛則易生邪毒,而氣具有自我調(diào)節(jié)功能,若氣的調(diào)控作用正常,自噬既無太過,也無不及,細胞內(nèi)部各種功能活動則取得協(xié)調(diào)平衡,內(nèi)環(huán)境得到穩(wěn)定[20]。當正氣不足,氣的防御功能異常,細胞抗邪能力下降,自噬不足,外邪(致病菌)首先攻破人體免疫的第一道防線(入侵腸上皮細胞),繼而因正氣虛弱無法有效激活自噬網(wǎng)絡調(diào)控,自噬相關基因低表達,無法清除胞內(nèi)菌和有害物質(zhì),為炎癥的進一步發(fā)展提供了機會。故認為自噬障礙是中醫(yī)氣虛的表現(xiàn)。因此,推測益氣解毒法防治IBD復發(fā)的有效機制可能是通過干預細胞自噬障礙以扶正,助腸EICs促使毒邪(致病菌)清除而發(fā)揮作用?;诖耍瑯?gòu)建AIEC感染EICs體外模型,檢測益氣解毒方藥干預后胞內(nèi)自噬基因表達,從而探討miRNA/ATG調(diào)控通路,一方面可為闡明IBD通過自噬障礙引起炎癥復發(fā)的病理機制以及益氣解毒方藥干預途徑,另一方面可為揭示IBD中醫(yī)氣虛毒邪內(nèi)伏理論的科學內(nèi)涵提供新思路。

    本院勞紹賢教授最早提出氣虛毒邪內(nèi)伏是IBD反復發(fā)作的病理機制,并以益氣解毒法為主制成了院內(nèi)制劑腸炎靈片在臨床推廣應用40余年,取得了滿意療效。益氣解毒方(腸炎靈片)主要由黨參、白術、救必應等藥物組成,其中:救必應為冬青科植物鐵冬青的干燥樹皮或根皮,味苦、性寒,異名為白木香,始載于《嶺南采藥錄》,稱“白木香,味苦,清熱毒”,為我國南方地區(qū)民間慣用草藥,具有清熱解毒、消腫止痛、利濕、祛風解毒等功效;黨參溫補中焦、益氣補虛,具有健脾功效。在此基礎上加入黃連、白花蛇舌草、烏藥、木香,黃連配以白花蛇舌草擅清胃腸濕熱,加強清熱燥濕、澀腸止痢、瀉火解毒的功效;木香、烏藥辛散溫通,使方中有升有降,亦可健脾益氣,行氣止痛。本研究通過對體外福氏志賀菌GIM1.539感染HCT116細胞模型進行miR130a過表達和沉默轉(zhuǎn)染后,分別予以大鼠益氣解毒方含藥血清和大鼠無藥血清進行干預,檢測細胞LC3的蛋白含量、ATG16L1的蛋白含量和基因表達以及miR130a的表達進行對照。結(jié)果顯示,含藥血清干預方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的LC3蛋白、ATG16L1蛋白和基因表達均較同組無藥血清干預方式的表達增多。含藥血清干預方式miR130a模擬物組、反義模擬物組和空白轉(zhuǎn)染組的miR130a基因表達均較同組無藥血清干預方式下降。表明益氣解毒方藥可能是通過干預miR130a的基因表達使ATG16L1蛋白得到調(diào)控。研究結(jié)果同時證實了LC3自噬蛋白的含量有所提升。

    綜上所述,益氣解毒方藥可能是通過抑制miRNAs的基因表達、上調(diào)ATG自噬基因的表達來維持腸上皮細胞自噬功能,從而有效清除胞內(nèi)菌控制IBD炎癥復發(fā)。但仍需進一步從自噬小體觀察、胞內(nèi)菌清除、炎癥因子、體內(nèi)實驗等方面證實。

    猜你喜歡
    物組無藥反義
    miR-365靶向調(diào)控USP22促進大腸癌細胞組蛋白修飾和EMT
    miR-122對腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死體積及胰島素樣生長因子-1受體通路的影響
    解剖學雜志(2021年6期)2021-12-31 03:25:34
    認識反義詞
    反義疑問句小練
    病害高發(fā)、無藥可醫(yī),究竟為何?諾偉司創(chuàng)新研究成果助力魚蝦盡情吃、縱橫長
    miRNA-19a在結(jié)腸癌中的表達及對結(jié)腸癌細胞增殖活性的影響分析
    海島詩人出診日記
    揚子江(2020年4期)2020-08-04 11:59:33
    這山望著那山高
    農(nóng)民發(fā)明無藥滅蟲機
    曉曉的大世界
    三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩欧美免费精品| 51国产日韩欧美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 黄色一级大片看看| 国产男靠女视频免费网站| 精品久久久久久久久av| 精品人妻熟女av久视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产爱豆传媒在线观看| 国产成人福利小说| 三级毛片av免费| 中文字幕久久专区| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩 亚洲 欧美在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产老妇女一区| 色综合亚洲欧美另类图片| 两个人视频免费观看高清| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 国内精品一区二区在线观看| 日本 av在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 女人被狂操c到高潮| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲精品在线观看二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 深夜a级毛片| 最好的美女福利视频网| 麻豆久久精品国产亚洲av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美性感艳星| 久久99热6这里只有精品| 在线国产一区二区在线| 精品久久久久久,| 超碰av人人做人人爽久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产三级在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 极品教师在线视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 丁香欧美五月| 久久伊人香网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产一区二区三区视频了| 亚洲激情在线av| 日韩高清综合在线| 中文在线观看免费www的网站| av天堂中文字幕网| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 91狼人影院| 欧美日本亚洲视频在线播放| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日韩欧美国产在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜精品在线福利| 免费av观看视频| av中文乱码字幕在线| 99国产综合亚洲精品| 欧美3d第一页| 日韩精品中文字幕看吧| 国产高清激情床上av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久久九九精品影院| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜福利免费观看在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜福利18| 久久中文看片网| 俺也久久电影网| av在线老鸭窝| 亚洲一区二区三区色噜噜| 天堂动漫精品| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲,欧美,日韩| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久九九热精品免费| 久久人妻av系列| 精品一区二区三区人妻视频| av在线天堂中文字幕| 免费看日本二区| 成人国产综合亚洲| 宅男免费午夜| 日韩有码中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲精品日韩av片在线观看| 十八禁人妻一区二区| 久久久精品大字幕| 男人舔奶头视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成年人精品一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久久久免费精品人妻一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜老司机福利剧场| 亚洲人成网站高清观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美一区二区亚洲| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 哪里可以看免费的av片| 久久久久性生活片| 网址你懂的国产日韩在线| 草草在线视频免费看| 成人无遮挡网站| 99热这里只有是精品50| 此物有八面人人有两片| 色播亚洲综合网| av在线老鸭窝| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲久久久久久中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 五月玫瑰六月丁香| 成人鲁丝片一二三区免费| 成年版毛片免费区| 亚洲,欧美精品.| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 中文字幕高清在线视频| 91av网一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品在线观看二区| 十八禁人妻一区二区| 中文字幕久久专区| 色在线成人网| 日本一二三区视频观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 村上凉子中文字幕在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 可以在线观看的亚洲视频| 久久久久久久久中文| av天堂在线播放| a级毛片a级免费在线| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲激情在线av| 久99久视频精品免费| 国产午夜精品论理片| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线天堂最新版资源| 色哟哟·www| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一个人看的www免费观看视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一区二区三区四区激情视频 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本在线视频免费播放| 悠悠久久av| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲三级黄色毛片| 午夜a级毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线观看舔阴道视频| 草草在线视频免费看| 午夜老司机福利剧场| 欧美色视频一区免费| av欧美777| 深爱激情五月婷婷| 丝袜美腿在线中文| 性色avwww在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费在线观看日本一区| 国内精品一区二区在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 黄片小视频在线播放| av在线天堂中文字幕| 毛片女人毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国语自产精品视频在线第100页| 久久精品国产自在天天线| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人影院久久av| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧美三级亚洲精品| 成人三级黄色视频| 九色成人免费人妻av| 一区二区三区四区激情视频 | 久久午夜福利片| 国产老妇女一区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 免费看a级黄色片| 久久国产乱子免费精品| 一级a爱片免费观看的视频| 免费电影在线观看免费观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精华国产精华精| 国产69精品久久久久777片| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 亚洲综合色惰| 成人午夜高清在线视频| 无人区码免费观看不卡| 亚洲在线自拍视频| 波野结衣二区三区在线| 色综合站精品国产| 十八禁国产超污无遮挡网站| 热99在线观看视频| 好男人在线观看高清免费视频| 特级一级黄色大片| 久久久久久国产a免费观看| 国产久久久一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本 欧美在线| 亚洲三级黄色毛片| 丰满的人妻完整版| 能在线免费观看的黄片| 熟女电影av网| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲三级黄色毛片| www.色视频.com| 国产亚洲欧美98| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 高清在线国产一区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩亚洲欧美综合| 久久香蕉精品热| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲在线观看片| 午夜福利欧美成人| 久久久久性生活片| 中文字幕av成人在线电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品不卡视频一区二区 | netflix在线观看网站| 一进一出好大好爽视频| 99热这里只有精品一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 99热只有精品国产| 精品久久久久久成人av| 成人三级黄色视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产一区二区三区视频了| 免费搜索国产男女视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产黄a三级三级三级人| 老司机午夜福利在线观看视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲,欧美,日韩| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久久久久久成人| 男人舔奶头视频| 亚洲国产欧美人成| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品一区二区免费欧美| 麻豆成人av在线观看| 免费av毛片视频| 日本一二三区视频观看| 国产色婷婷99| 国产老妇女一区| 亚洲av电影在线进入| 人妻久久中文字幕网| 日韩中文字幕欧美一区二区| 成年女人永久免费观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| .国产精品久久| 我要看日韩黄色一级片| 欧美精品国产亚洲| 欧美成人免费av一区二区三区| 观看免费一级毛片| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜两性在线视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 99在线视频只有这里精品首页| 伦理电影大哥的女人| 久久久成人免费电影| 热99re8久久精品国产| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成年女人永久免费观看视频| 国产av一区在线观看免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 嫩草影院新地址| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久久大精品| 在线看三级毛片| 欧美激情久久久久久爽电影| av天堂在线播放| 嫩草影院精品99| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲精品av在线| 精品人妻1区二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲专区国产一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 国产日本99.免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产高清激情床上av| 午夜精品在线福利| 赤兔流量卡办理| 99精品久久久久人妻精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 色综合站精品国产| 怎么达到女性高潮| 波多野结衣高清作品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲综合色惰| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99热这里只有是精品在线观看 | 日本黄色片子视频| 亚洲真实伦在线观看| 久久久国产成人免费| 国产视频一区二区在线看| 欧美激情在线99| 久久久久免费精品人妻一区二区| 乱人视频在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 欧美精品国产亚洲| 欧美一级a爱片免费观看看| 一进一出好大好爽视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 午夜福利在线观看吧| 免费看光身美女| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 国产精品久久视频播放| 欧美最新免费一区二区三区 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 国产综合懂色| 久久久成人免费电影| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产精品sss在线观看| 在线看三级毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 简卡轻食公司| 精品人妻偷拍中文字幕| 51国产日韩欧美| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品欧美国产一区二区三| av天堂中文字幕网| 久久久久国内视频| 全区人妻精品视频| 男插女下体视频免费在线播放| av福利片在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 一个人看的www免费观看视频| 免费搜索国产男女视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 天天躁日日操中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 啪啪无遮挡十八禁网站| av天堂中文字幕网| 国产精华一区二区三区| 伊人久久精品亚洲午夜| www日本黄色视频网| 日本与韩国留学比较| 深爱激情五月婷婷| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 久99久视频精品免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 色哟哟·www| 黄色丝袜av网址大全| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜福利免费观看在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 床上黄色一级片| 99久国产av精品| 1000部很黄的大片| 国产黄a三级三级三级人| 天堂影院成人在线观看| 熟女电影av网| 亚洲七黄色美女视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲乱码一区二区免费版| 嫁个100分男人电影在线观看| 赤兔流量卡办理| 在线观看一区二区三区| 一本久久中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费av毛片视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久久久精品吃奶| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久九九热精品免费| 日韩欧美 国产精品| 三级毛片av免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99热这里只有精品一区| 亚洲av美国av| 午夜视频国产福利| 色哟哟·www| 天堂网av新在线| 欧美午夜高清在线| 99热这里只有精品一区| 精品久久久久久,| bbb黄色大片| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人精品一区二区免费| 亚洲激情在线av| 成年女人毛片免费观看观看9| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品久久视频播放| 搞女人的毛片| 色哟哟·www| 九色国产91popny在线| 精品国产三级普通话版| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 级片在线观看| 深夜a级毛片| 在线看三级毛片| av中文乱码字幕在线| 精品日产1卡2卡| www.色视频.com| 脱女人内裤的视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜福利在线观看吧| 人妻夜夜爽99麻豆av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 真实男女啪啪啪动态图| 露出奶头的视频| 国内精品一区二区在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 午夜福利高清视频| 69av精品久久久久久| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久人人精品亚洲av| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲av免费在线观看| 成人精品一区二区免费| 丝袜美腿在线中文| 国产精品一区二区性色av| 免费在线观看成人毛片| 一a级毛片在线观看| 国产综合懂色| 久久久精品欧美日韩精品| 激情在线观看视频在线高清| 精品欧美国产一区二区三| 精品人妻1区二区| 内地一区二区视频在线| 久久精品影院6| 91狼人影院| 国产精品久久视频播放| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产主播在线观看一区二区| 窝窝影院91人妻| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品久久久久久精品电影| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 性色av乱码一区二区三区2| 全区人妻精品视频| 99热这里只有是精品在线观看 | 色av中文字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产在视频线在精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 免费在线观看日本一区| 岛国在线免费视频观看| av在线蜜桃| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久中文看片网| 中文资源天堂在线| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 丰满乱子伦码专区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一级作爱视频免费观看| 少妇丰满av| 亚洲人成网站高清观看| 一夜夜www| 九九在线视频观看精品| 色视频www国产| 99热只有精品国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成年人黄色毛片网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜亚洲福利在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 人妻久久中文字幕网| 床上黄色一级片| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 看黄色毛片网站| 成人无遮挡网站| 此物有八面人人有两片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 超碰av人人做人人爽久久| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 看黄色毛片网站| 久久久久国内视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲av熟女| 日韩欧美 国产精品| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人特级av手机在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久久久久久大av| 国产伦在线观看视频一区| 欧美成狂野欧美在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产欧美日韩精品一区二区| 夜夜爽天天搞| av在线观看视频网站免费| 亚洲av成人精品一区久久| а√天堂www在线а√下载| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久精品影院6| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 色吧在线观看| 久久久久久久久久成人| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲美女视频黄频| 18+在线观看网站| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本五十路高清| 国产高清三级在线| 久久6这里有精品| 日韩精品青青久久久久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 我要搜黄色片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 高清在线国产一区| 观看美女的网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费观看人在逋| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲av一区综合| 日本免费一区二区三区高清不卡| 直男gayav资源| 欧美日韩乱码在线| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| www日本黄色视频网| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲 国产 在线| 色视频www国产| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 怎么达到女性高潮| 99国产综合亚洲精品| 成人国产综合亚洲| 亚洲成av人片免费观看| av中文乱码字幕在线| 精品久久久久久成人av|