酶法降解醋糟發(fā)酵酒精

劉琨毅，陸兵，王琪*，張強(qiáng)，李秀萍

1(宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓,644003)2(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明,650000)3(宜賓市思坡醋業(yè)有限責(zé)任公司，四川 宜賓,644000)

醋是我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]。然而因其固態(tài)發(fā)酵的特點(diǎn)，在釀制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的醋糟[3-4]。醋糟數(shù)量較大，如果被當(dāng)作廢物丟棄，不僅污染環(huán)境，而且浪費(fèi)資源，更嚴(yán)重的是影響了釀造行業(yè)的健康發(fā)展[5-6]。目前如何高價(jià)值利用醋糟成了研究熱點(diǎn)，其再利用的途徑主要有生產(chǎn)飼料、栽培基質(zhì)和生物能源等[7-8]。醋糟用于飼料生產(chǎn)可提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性，但此法會(huì)有副產(chǎn)物的產(chǎn)生，環(huán)境污染問(wèn)題依舊沒(méi)有徹底解決[9-12]。醋糟作為栽培基質(zhì)可以降低栽培生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，但主要集中應(yīng)用在普通價(jià)值的平菇和景觀植物[13-14]。醋糟在生物質(zhì)能方面的利用主要有生產(chǎn)沼氣、熱裂解和厭氧發(fā)酵[15]，這些研究?jī)H限于機(jī)理和過(guò)程方面，實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步的技術(shù)突破。

如何高值化的利用釀醋行業(yè)的發(fā)酵副產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)變廢為寶，做到醋糟的零排放，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)形成合理的生態(tài)產(chǎn)業(yè)鏈及副產(chǎn)物資源化高效利用模式，對(duì)我國(guó)的資源開(kāi)發(fā)與環(huán)境保護(hù)具有十分重要的意義，也是今后釀造行業(yè)的重要課題。本試驗(yàn)主要探析醋糟分步降解為酒精，希望為醋糟的有效循環(huán)利用提供新的突破。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮醋糟(為工廠淋醋完成后，未經(jīng)其他任何處理的濕醋渣，冷凍保存)、棉籽殼、麩皮：宜賓市S醋業(yè)有限公司；葡聚糖淀粉酶NS22035(酶活為21.17 IU/mL)、木聚糖酶NS22083(酶活為17.08 IU/mL)、纖維素酶NS22086(酶活為25.47 IU/mL)、復(fù)合酶NS22002(其中主要的β-葡萄糖苷酶酶活為6.77 U/mL)：諾維信天津分公司；南陽(yáng)五號(hào)酵母(1300)：四川省菌種保藏中心；NaOH、蔗糖、木糖、間苯三酚、檸檬酸、檸檬酸鈉(分析純)：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

101C-3B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海市崇明試驗(yàn)儀器廠；BS210S型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV-1100型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；HZO-X100型氣浴搖床，太倉(cāng)豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；PHs-3c型精密pH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；KH19A型離心機(jī)，湖南凱達(dá)離心機(jī)廠；QP2010型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；TR-5MS型色譜柱(30.0 m×320 μm×0.25 μm)，美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)流程

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 回收鮮醋糟中粗淀粉的試驗(yàn)

按照劉躍紅等[16]降解白酒丟糟的方法，將100 g鮮醋糟(含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)68%)裝入500 mL玻璃三角瓶中，加入100 mL濃度為0.05 mol/L的檸檬酸鹽緩沖溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為5.0。加入不同含量的葡聚糖淀粉酶NS22035，三角瓶放置于氣浴搖床內(nèi)處理72 h，搖床的條件設(shè)定為溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。反應(yīng)結(jié)束后，用真空抽濾的方法進(jìn)行固液分離，固體經(jīng)60 ℃烘干后用于后續(xù)試驗(yàn)，回收得到的液體用于后續(xù)同步糖化酒精發(fā)酵補(bǔ)充糖液。

1.4.2 NaOH預(yù)處理回收粗淀粉后干醋糟的單因素試驗(yàn)

將回收殘余淀粉后的干醋糟經(jīng)粉碎后與一定濃度的NaOH溶液混合均勻，NaOH濃度0.5～2.5 mol/L，固液比1∶6～1∶16(g∶mL)，反應(yīng)時(shí)間在30～90 min，反應(yīng)溫度45～85 ℃。待反應(yīng)結(jié)束后，用真空抽濾的方法進(jìn)行固液分離，并在60℃下烘干至恒重。將干醋糟、木聚糖酶NS22083(木聚糖酶與干醋糟質(zhì)量比為0.1∶100)、100 mL濃度為0.05 mol/L的檸檬酸鹽緩沖溶液放入250 mL三角瓶中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，放入溫度為50 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的氣浴搖床內(nèi)反應(yīng)96 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行固液分離，并測(cè)定液體中還原糖的濃度，固體在60 ℃恒溫下干燥至恒重待用，液體回收用于后續(xù)同步糖化酒精發(fā)酵。

1.4.3 NaOH預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取NaOH濃度(A)、固液比(B)、預(yù)處理時(shí)間(C)、預(yù)處理溫度(D)為考察因素，以還原糖產(chǎn)率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[17]，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定NaOH預(yù)處理干醋糟的最佳工藝條件，因素與水平見(jiàn)表1。

1.4.4 酵母菌種培養(yǎng)

菌種活化：將南陽(yáng)五號(hào)酵母(1300)菌種轉(zhuǎn)接至10 °Brix 的米曲汁斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)48 h待用。

表1 NaOH預(yù)處理工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for process conditions optimization of NaOH pretreatment

種子制備：取250 mL三角瓶，加入10 °Brix的米曲汁100 mL，并在121℃條件下滅菌15 min，冷卻后挑取活化斜面培養(yǎng)基上的新鮮酵母菌苔1餌接入培養(yǎng)基中，紗布封口，27 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。之后將種子液進(jìn)行擴(kuò)培，每次擴(kuò)培取出種子液都是10%，培養(yǎng)溫度每次提高3 ℃，120 r/min培養(yǎng)72 h，使酵母菌數(shù)達(dá)到107CFU/mL以上后待用。

1.4.5 同步糖化發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將纖維素酶及復(fù)合酶加入到經(jīng)木聚糖酶降解后的干醋糟進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。將經(jīng)木聚糖酶NS22083降解后的干醋糟、回收殘余淀粉收集到的糖液、木聚糖酶NS22083降解后的糖液放入500 mL三角瓶中，同時(shí)加入3.56 mL纖維素酶NS22086 (0.2 mL酶/g固體)、0.89 mL復(fù)合酶NS22002 (0.05 mL酶/g固體)與適量的酵母菌種子液，三角瓶口用1個(gè)橡膠套住，用來(lái)收集發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2，三角瓶放入氣浴搖床中，恒溫處理若干小時(shí)。選擇酵母菌接種量(G)、搖床轉(zhuǎn)速(H)、處理溫度(I)、處理時(shí)間(J)為4因子，以酒精產(chǎn)率為優(yōu)化目標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)(見(jiàn)表2)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal test design table

1.5 分析方法

醋糟主要成分中，粗淀粉、灰分、水分等按照GB/T 5009.9—2016[18]、GB/T 6438—2007[19]和GB/T 6435—2014[20]測(cè)定；纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的分析參照NREL法測(cè)定[21]；還原糖采用DNS法測(cè)定[22]；酒精采用氣相色譜異丙醇內(nèi)標(biāo)法測(cè)定[23]。經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)得到試驗(yàn)數(shù)據(jù)，醋糟主要成分如表3所示。

表3 醋糟主要組成Table 3 Composition of the vinegar residue

還原糖產(chǎn)率、酒精產(chǎn)率的計(jì)算方法[16]如公式(1)、(2)所示：

(1)

式中：SY是還原糖的產(chǎn)率，mg/g；WTSP是經(jīng)過(guò)酶降解后的還原糖的質(zhì)量,g；WPDVR是經(jīng)過(guò)烘干后的醋糟質(zhì)量。

(2)

式中：EP是酒精產(chǎn)率，g/100 g；WEPF是同步糖化發(fā)酵后酒精質(zhì)量,g;WCDVR是經(jīng)過(guò)NaOH預(yù)處理后的醋糟質(zhì)量,g。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡聚糖淀粉酶對(duì)回收鮮醋糟粗淀粉的影響

利用葡聚糖淀粉酶NS22035回收鮮醋糟中的粗淀粉，測(cè)定在不同葡聚糖淀粉酶NS22035用量的條件下溶液中還原糖的濃度，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，溶液中還原糖濃度隨著酶用量增加而升高；當(dāng)葡聚糖淀粉酶NS22035用量為0.22 mL/100 g時(shí)，溶液中還原糖的質(zhì)量濃度達(dá)到最高的(18.6±0.1)g/L。當(dāng)酶用量在0.19 mL/100 g時(shí)，溶液中還原糖的濃度較酶用量在0.22 mL/100 g時(shí)略低，但兩者差異不顯著(P>0.05)。故考慮酶用量成本，選擇0.19 mL/100 g作為回收鮮醋糟中粗淀粉的酶用量。在此酶用量下，可回收液體96 mL，還原糖質(zhì)量濃度為(18.2±0.2)g/L，鮮醋糟中30.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的粗淀粉被回收；回收固體為(27.8±0.6)g，固體回收率為87.2%。

圖1 淀粉酶用量對(duì)回收鮮醋糟粗淀粉的影響Fig.1 Effects of the amount of amylase on crudestarch recovery from fresh vinegar residue注：不相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 NaOH濃度對(duì)酶降解醋糟的影響

在固液比為1∶10(g∶mL)、預(yù)處理溫度65 ℃、預(yù)處理時(shí)間60 min的條件下，考察NaOH濃度在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L時(shí)的變化，處理回收淀粉后的干醋糟對(duì)酶解的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨著NaOH濃度的不斷增加，還原糖的產(chǎn)率也逐漸提高，還原糖的產(chǎn)率最高達(dá)到(395.7±4.2)mg/g。其原因可能是NaOH濃度越高，其溶解原料中木質(zhì)素的能力就越強(qiáng)，同時(shí)醋糟中纖維素等物質(zhì)損耗也隨著NaOH濃度升高而增多。當(dāng)NaOH濃度為2 mol/L時(shí)，還原糖的產(chǎn)率為(388.7±7.0)mg/g,與還原糖最高產(chǎn)率之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此，選擇1.5～2.5 mol/L的NaOH濃度用于后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 NaOH濃度對(duì)酶降解醋糟的影響Fig.2 Effects of NaOH concentration onenzymatic degradation of vinegar residue

2.3 固液比對(duì)酶降解醋糟的影響

在NaOH濃度為2 mol/L、預(yù)處理溫度65 ℃及預(yù)處理時(shí)間60 min條件下，探討固液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16(g∶mL)對(duì)酶降解醋糟效果的影響，結(jié)果如圖3所示。溶液中還原糖的產(chǎn)率隨著液體比例的增加而增加，最高產(chǎn)率達(dá)到(476.0±2.3)mg/g。由于NaOH溶液的增多，增大了原料與溶液接觸的面積，使其反應(yīng)更加充分。故選擇較高的液體比例對(duì)后續(xù)酶解反應(yīng)越為有利，當(dāng)固液比達(dá)到1∶14 后，繼續(xù)增加液體比例雖能增加酶解溶液中還原糖的產(chǎn)率但增加的數(shù)值不顯著(P>0.05)。因此，選擇1∶12、1∶14、1∶16的固液比用于后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 固液比對(duì)酶降解醋糟的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on enzymaticdegradation of vinegar residue

2.4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)酶降解醋糟的影響

在NaOH濃度為2 mol/L、固液比1:14(g∶mL)及預(yù)處理溫度為65℃時(shí)，分別考察預(yù)處理時(shí)間30、45、60、75、90 min對(duì)酶降解醋糟效果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖的產(chǎn)率逐漸提高，預(yù)處理時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)原料的溶解越充分。當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為75 min時(shí)，酶水解液中還原糖的產(chǎn)率為(548.7±7.5)mg/g，雖較預(yù)處理時(shí)間為90 min時(shí)還原糖的(557.7±3.5)mg/g產(chǎn)率低，但二者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)?？紤]到成本問(wèn)題，選擇預(yù)處理時(shí)間為60～90 min用于響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)酶降解醋糟的影響Fig.4 Effect of pretreatment time on enzymaticdegradation of vinegar residue

2.5 預(yù)處理溫度對(duì)酶降解醋糟的影響

在NaOH濃度為2 mol/L、固液比1∶14(g∶mL)及預(yù)處理時(shí)間75 min時(shí)，研究預(yù)處理溫度分別在45、55、65、75、85 ℃時(shí)對(duì)酶降解醋糟效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5知，隨著NaOH預(yù)處理溫度的升高，溶液中還原糖的產(chǎn)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)預(yù)處理溫度為75 ℃時(shí)，酶解液中還原糖的產(chǎn)率達(dá)到最高的(627.0±5.6)mg/g，表明75 ℃是NaOH預(yù)處理醋糟較佳的溫度，當(dāng)體系的溫度高于或低于75 ℃時(shí)，還原糖的產(chǎn)率均低于627.0 mg/g。因此選擇65～85 ℃用于后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖5 預(yù)處理溫度對(duì)酶降解醋糟的影響Fig.5 Effect of pretreatment temperature onenzymatic degradation of vinegar residue

2.6 NaOH預(yù)處理干醋糟工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[24-25]，考察4個(gè)因素對(duì)酶解液中還原糖產(chǎn)率的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 NaOH預(yù)處理工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments for process conditions optimization of NaOH pretreatment

注：“*”表示對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)，“**”表示對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)。

由表5可知，4個(gè)因素對(duì)還原糖產(chǎn)率影響的主次順序依次為A>B>D>C，其中交互項(xiàng)BC和BD對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)A、B對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)；二次項(xiàng)A2、B2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，C2對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。

通過(guò)Design Expert軟件分析確定NaOH預(yù)處理醋糟的最佳工藝條件為NaOH濃度2.2 mol/L、固液比1∶14(g∶mL)、預(yù)處理時(shí)間88 min及預(yù)處理溫度70 ℃。在此最優(yōu)工藝條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，得到還原糖產(chǎn)率為(653.7±4.3)mg/g；固液分離后，得到液體94 mL，回收固體17.8 g，固體回收率為64.0%。

2.7 酵母菌接種量對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響

酵母菌接種量的大小直接影響同步糖化發(fā)酵酒精的產(chǎn)量，在發(fā)酵容器中分別按糖液的6%、8%、10%、12%、14%接入酵母菌種子液，在搖床轉(zhuǎn)速120 r/min及發(fā)酵溫度30℃的條件下發(fā)酵72 h后測(cè)得酒精的產(chǎn)量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酵母菌接種量對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of inoculum concentration of saccharomyceteson simultaneous saccharification and fermentation

由圖6知，隨著酵母菌接種量的提高，酒精的產(chǎn)率呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)接種量為12%時(shí)，酒精的產(chǎn)率達(dá)到最高的(27.3±0.6)g/100 g。之后開(kāi)始下降，這可能是由于接種量過(guò)大，酵母菌大量繁殖所致，使原料部分用于酵母的生長(zhǎng)繁殖，而影響酒精的產(chǎn)率。故選擇最優(yōu)酵母接種量為12%用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響

發(fā)酵容器中按糖液的12%接入酵母菌種子液，在處理溫度30 ℃、處理時(shí)間72 h的條件下，考察搖床轉(zhuǎn)速分別為60、80、100、120、140 r/min時(shí)同步糖化發(fā)酵酒精的產(chǎn)率，結(jié)果如圖7所示。

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of table rotational speed on simultaneoussaccharification and fermentation

由圖7可知，酒精的產(chǎn)率隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高而升高，最高達(dá)到(27.8±0.8)g/100 g。搖床轉(zhuǎn)速的不斷升高促進(jìn)了發(fā)酵醪液中反應(yīng)速率的提升，但提升的幅度隨著轉(zhuǎn)速的升高而逐漸減小。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，其酒精的產(chǎn)率雖略低于140 r/min時(shí)的酒精產(chǎn)率，但二者無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從節(jié)能角度考慮選擇搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.9 處理溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響

發(fā)酵容器中按糖液的12%接入酵母菌種子液，在搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、處理時(shí)間72 h的條件下，探討處理溫度分別為26、28、30、32、34 ℃時(shí)同步糖化發(fā)酵酒精的產(chǎn)率，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可知，酵母菌、復(fù)合酶同步糖化發(fā)酵的最適溫度為30 ℃，在此條件下，酒精產(chǎn)率為(27.3±0.6)g/100 g。當(dāng)反應(yīng)體系的溫度高于或低于30 ℃時(shí)，都未能使酵母菌與復(fù)合酶發(fā)揮最佳的處理效果，導(dǎo)致酒精產(chǎn)率均低于27.3 g/100 g。因此，選擇處理溫度為30 ℃用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖8 處理溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of treatment temperature onsimultaneous saccharification and fermentation

2.10 處理時(shí)間對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響

在酵母菌接種量12%、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、處理溫度30 ℃的條件下，分別研究處理時(shí)間為48、60、72、84、96 h時(shí)同步糖化發(fā)酵酒精的產(chǎn)率，結(jié)果如圖9所示。

圖9 處理時(shí)間對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響Fig.9 Effect of treatment time on simultaneoussaccharification and fermentation

由圖9可知，隨處理時(shí)間的增加，反應(yīng)體系中酒精的產(chǎn)率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，處理時(shí)間為84 h時(shí)，酒精的產(chǎn)率最高達(dá)到了(31.8±1.1)g/100 g。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精可能被轉(zhuǎn)化為酸等其他代謝產(chǎn)物，致使酒精產(chǎn)率下降[26]。因此，選擇處理時(shí)間為84 h用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.11 同步糖化發(fā)酵的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果選取酵母菌接種量、搖床轉(zhuǎn)速、處理溫度和處理時(shí)間為4因子，以酒精產(chǎn)率為優(yōu)化目標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

由表6知，影響酒精產(chǎn)率的主次因素為I>G>H>J，即處理溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵酒精產(chǎn)率的影響最強(qiáng)，其次是酵母菌接種量，再次為搖床轉(zhuǎn)速。從k值的大小可知，最優(yōu)組合為G3H3I2J2，即酵母菌接種量14%、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min、處理溫度30 ℃、處理時(shí)間84 h。但該條件不在表6所示的9組實(shí)驗(yàn)中，故對(duì)該條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到酒精產(chǎn)率為(34.7±0.9)g/100 g，表明G3H3I2J2為最優(yōu)條件。

表6 同步糖化發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Orthogonal test and analysis of simultaneous saccharification and fermentation

為進(jìn)一步驗(yàn)證以上分析結(jié)果，以酒精產(chǎn)率為考察對(duì)象對(duì)其進(jìn)行方差分析，由于J(處理時(shí)間)這個(gè)因素均方值較小，因此將其作為誤差項(xiàng)計(jì)算F值。由表7可知，I因素(處理溫度)對(duì)酒精產(chǎn)率的影響顯著(P<0.10)。因此，選擇G3H3I2J2作為同步糖化酒精發(fā)酵的最優(yōu)條件。

表7 正交試驗(yàn)方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test

注：“*”表示對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.10)。

3 討論

試驗(yàn)利用醋糟中粗淀粉和纖維質(zhì)含量較多的特點(diǎn)，采用復(fù)合酶法酶解纖維質(zhì)原料的方法，將醋糟中的纖維質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為酒精。在同步化糖化生產(chǎn)酒精環(huán)節(jié)中，搖床轉(zhuǎn)速在一定范圍內(nèi)與酵母菌的增殖成正相關(guān)，搖床轉(zhuǎn)速越快，供氧量越高，菌體量越高，進(jìn)而代謝產(chǎn)生的乙醇濃度也越高；當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)一定水平后，菌體增殖可能已經(jīng)達(dá)到上限，因而其代謝能力并未顯著提高。酵母菌的最適生長(zhǎng)溫度為28～30 ℃[27]，酵母菌與復(fù)合酶NS22002同步化糖化生產(chǎn)酒精的最適溫度在30 ℃左右，表明復(fù)合酶NS22002并未對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生不良影響。

通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)，可得到34.7 g/100 g的酒精產(chǎn)率，高于劉躍紅等[16]利用白酒丟糟生產(chǎn)酒精28.7 g/100 g的酒精產(chǎn)率，同時(shí)也高于徐友海等[28]利用木薯渣生產(chǎn)酒精16 g/100 g的酒精產(chǎn)率，初步實(shí)現(xiàn)了醋糟生產(chǎn)酒精的可能。

在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)1 L酒精所消耗各種酶、NaOH等試驗(yàn)材料的總費(fèi)用為27.4元(見(jiàn)表8)。對(duì)比市場(chǎng)中1 L酒精(食品級(jí))25～30元的售價(jià)，表明該試驗(yàn)方法具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。后續(xù)對(duì)醋糟同步糖化生產(chǎn)酒精工藝中的其他環(huán)節(jié)進(jìn)一步優(yōu)化，例如優(yōu)化試驗(yàn)菌種、復(fù)合酶的種類等，使其具備工業(yè)化生產(chǎn)酒精的可行性。

表8 生產(chǎn)1 L酒精所需耗材Table 8 Consumables for production of 1 L alcohol

4 結(jié)論

利用葡聚糖淀粉酶NS22035回收鮮醋糟中的殘余淀粉，得到富含葡萄糖的糖液用做后續(xù)同步糖化發(fā)酵前期酵母菌糖液的消耗，該部分回收淀粉所得還原糖濃度為18.2 g/L，鮮醋糟中30.1%的粗淀粉被回收。經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的NaOH預(yù)處理醋糟的各個(gè)因素條件為NaOH濃度2.2 mol/L、固液比1∶14(g∶mL)、預(yù)處理時(shí)間88 min及預(yù)處理溫度70 ℃。在該條件下，后續(xù)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精的試驗(yàn)條件，在酵母菌接種量14%、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min、處理溫度30 ℃、處理時(shí)間84 h的條件下可得到34.7 g/100 g的酒精產(chǎn)率，經(jīng)成本核算后，初步實(shí)現(xiàn)了醋糟生產(chǎn)酒精的可行性。