魔芋葡甘聚糖-海藻酸鈉復(fù)合益生菌微膠囊的構(gòu)建及性能評(píng)價(jià)

周艷林，吳影,2, 3，馬雨浩，閆佳琦，王大紅,2，張紅梅,3，古紹彬, 2, 3*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023) 2(河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽，471023)3(食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽，471023)

益生菌被定義為在適當(dāng)?shù)那闆r下，對(duì)宿主健康有益的活的微生物。它們可以通過保持健康的腸道菌群，抑制病原菌生長(zhǎng)，緩解便秘，刺激免疫系統(tǒng)，合成維生素和抗菌劑，提高鈣的吸收，對(duì)人體產(chǎn)生有益的作用[1]。然而，胃的酸性條件和分泌到十二指腸的膽汁鹽是細(xì)菌生存的主要障礙[2]。內(nèi)源乳化法制作出的微膠囊，粒徑大小能夠控制，且制作過程中用到的都是無毒試劑，運(yùn)用這種方法已經(jīng)成功包埋乳酸菌、胰島素等生物活性組分，因而內(nèi)源乳化法可以用來制備益生菌微膠囊[3]。

魔芋葡甘聚糖是從我國(guó)魔芋塊莖中提取的水溶性黏稠膳食纖維[4]，是一種天然高分子多糖，具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)腸道微生物代謝和減肥等功能[5]。CONNOLLY等[6]研究發(fā)現(xiàn)魔芋葡甘聚糖發(fā)酵后，雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等不同有益菌的菌群數(shù)量均可顯著增加。CHEN等[7]研究魔芋葡甘聚糖具有益生元效應(yīng)，其能夠顯著提高糞便中雙歧桿菌和乳酸菌的含量。此外，魔芋葡甘聚糖經(jīng)常作為添加劑在食品中應(yīng)用。在湯、肉汁、蛋黃醬和果醬等食品中具有增稠、成膠、乳化、穩(wěn)定和水結(jié)合等特性[8]。WEN等[9]以魔芋葡甘聚糖為原料，在溫和條件下通過脫乙酰反應(yīng)和物理交聯(lián)法制備了DNA控釋水凝膠。WANG等[10]以海藻酸鈉、魔芋葡甘聚糖為原料，制備了緩釋微球。通過紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉和魔芋葡甘聚糖間存在微弱氫鍵結(jié)合和靜電相互作用，電鏡照片顯示微球表面形成了有助于提高對(duì)藥物的包埋能力的明顯凹痕。采用靜電絡(luò)合法制備了羧甲基魔芋葡甘聚糖-殼聚糖納米膠囊，并將其用于L-天冬氨酸酶固定化，與天然酶相比，固定化酶表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性和活性[11]。目前，有關(guān)魔芋葡甘聚糖作為壁材包埋益生菌的研究少有報(bào)道，本文重點(diǎn)研究魔芋葡甘聚糖作為壁材對(duì)復(fù)合益生菌進(jìn)行包埋工藝條件，考察其主要性能指標(biāo)，并將微膠囊灌胃小鼠，研究魔芋葡甘聚糖對(duì)小鼠主要生長(zhǎng)性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假鏈狀雙歧桿菌、植物乳桿菌HZLp-005、干酪乳桿菌HZLc-017，實(shí)驗(yàn)室菌株。

ALG，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所； KGM(90～100萬Da)，合肥博美生物科技有限公司；納米級(jí)分析純CaCO3，上海啟臣有限公司；3號(hào)膽鹽、胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)，Biosharp公司；BALB/C小鼠(雄性、清潔級(jí))，由河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HJ-3型磁力攪拌器，金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠；TM3030plus掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術(shù)公司；LG-0.2真空冷凍干燥機(jī)，沈陽新陽速凍設(shè)備制造公司;奧林巴斯BX50顯微鏡，瑞戈(上海)實(shí)業(yè)有限公司；其他為實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

將保存的雙歧桿菌在液體MRS培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24 h，將植物乳桿菌、干酪乳桿菌在液體MRS培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18 h，并根據(jù)3%的接種量接種，連續(xù)活化傳代2～3次。將活化好的種子液4 000 r/min離心10 min，用生理鹽水洗滌2次，將洗滌后的菌體重懸于生理鹽水中，使此濃縮菌液為109CFU/mL。

1.3.2 益生菌微膠囊的制備工藝優(yōu)化

1.3.2.1 益生菌微膠囊的制備

益生菌微膠囊的制備過程如下[12]：分別稱取海藻酸鈉、魔芋葡甘聚糖和CaCO3粉末，緩慢加入水中，攪拌均勻，配制含海藻酸鈉、魔芋葡甘聚糖和CaCO3的混合液，溶脹24 h左右；將菌懸液與配制的混合溶液按照體積比1∶3混合均勻后；加入到大豆油中(含體積分?jǐn)?shù)1%的Span80)，機(jī)械攪拌形成油包水液滴后，加入200 μL冰醋酸繼續(xù)攪拌，然后用水(含體積分?jǐn)?shù)1%的吐溫80) 洗滌微膠囊，最后將收集得到的微膠囊保存于4℃冰箱中。

1.3.2.2 微膠囊制備工藝優(yōu)化

通過單因素試驗(yàn)測(cè)定不同ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)；KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、0.6%、1.2%、1.8%、2.4%)；水油體積比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)；CaCO3和ALG質(zhì)量比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)對(duì)微膠囊包埋效果的影響。采用4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究4個(gè)因素對(duì)微膠囊包埋率的影響。KGM-ALG微膠囊配方L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels of orthogonal test

1.3.3 微膠囊包埋產(chǎn)率的測(cè)定

微膠囊包埋率的測(cè)定[13]：將1 g微膠囊加入到9 mL磷酸鹽緩沖溶液中，在搖床中于37℃、230 r/min搖晃30 min，取樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)，計(jì)算最初添加的活菌數(shù)。益生菌包埋率(embedding rate，EY)可表示為公式(1)：

(1)

式中：m0，起始添加的活菌數(shù)，CFU/mL；m2，微膠囊中包埋的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 微膠囊的形態(tài)觀察及粒徑的分析

用玻璃棒沾取微膠囊的分散溶液1滴，置于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。用測(cè)微尺測(cè)定膠囊的粒徑，計(jì)數(shù) 100個(gè)以上，取平均值。通過掃描電子顯微鏡觀察微膠囊冷凍干燥后的結(jié)構(gòu)。

1.3.5 微膠囊耐受性

1.3.5.1 微膠囊對(duì)模擬胃液的耐受試驗(yàn)

取1 g微膠囊置于9 mL胃液中，于37℃、 230 r/min分別處理0、30、60、90、120 min后取樣計(jì)數(shù)；未包封的菌為對(duì)照。

1.3.5.2 微膠囊在模擬腸液中的釋放試驗(yàn)

取1 g微膠囊置于9 mL腸液中，于37 ℃、230 r/min分別處理0、30、60、90、120 min后取樣計(jì)數(shù)。

1.3.5.3 微膠囊在模擬連續(xù)的胃腸道試驗(yàn)

取1 g微膠囊置于9 mL胃液[14]中，于37℃、230 r/min條件下處理60 min后取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，離心收集微膠囊后加入膽鹽溶液，30 min后取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，離心，用生理鹽水洗滌后加入腸液，振蕩處理60 min后取樣計(jì)數(shù)；未包封的菌為對(duì)照。

1.3.6 微膠囊壁材對(duì)小鼠的影響

1.3.6.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別作為對(duì)照組(灌胃生理鹽水)、ALG組、ALG+KGM組，每只小鼠下午4時(shí)灌胃，對(duì)照組灌胃0.2 mL生理鹽水，ALG組灌胃0.2 mL混勻的ALG微膠囊溶液，ALG+KGM組灌胃0.2 mL混勻的ALG+KGM微膠囊溶液，微膠囊質(zhì)量濃度為1 g/mL，每天1次，試驗(yàn)持續(xù)6周，監(jiān)測(cè)小鼠的死亡癥狀、體重變化、行為異常等情況。

1.3.6.2 血清生化指標(biāo)分析

頸椎脫臼法致死小鼠后，主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心6 min，分離得到小鼠血清并用全自動(dòng)生化分析儀分析小鼠血清各個(gè)生化指標(biāo)，其原理及實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)試劑盒所帶說明書進(jìn)行。

1.3.6.3 肝臟、腎臟組織切片染色

小鼠處死后，立即將肝臟、腎臟用10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定，固定好后，切成小塊，放入包埋籠中進(jìn)行沖洗、脫水、包埋、切片、烤片、染色(蘇木精染色10 min，用蒸餾水返藍(lán)5～15 min，用伊紅染液進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)的染色)，中性樹膠封片后，晾干鏡檢。

1.3.6.4 腸道微生物多樣性測(cè)定

小鼠腸道微生物多樣性測(cè)定送檢至美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。高通量測(cè)序是在Illumina MiSeq平臺(tái)上測(cè)序完成。然后根據(jù)OTU分析結(jié)果，通過使用在線平臺(tái)軟件，對(duì)樣本進(jìn)行物種注釋和多樣性進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Oringin統(tǒng)計(jì)分析軟件分析和處理，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后用3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，各組數(shù)據(jù)間的差異用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行Duncan’s多重比較分析，當(dāng)P<0.05時(shí)視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌微膠囊的制備

2.1.1 KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包埋率的影響

KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包埋率的影響如圖1所示。從圖中可看出，當(dāng)KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)，微膠囊包埋率最大，隨著KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，微膠囊的包埋率增加，這可能是KGM的添加，使海藻酸鈉凝膠孔隙變小，可有效提高微膠囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用；由于KGM其本身黏度較大，隨著其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，使要包埋的菌體分散較為困難，進(jìn)而引起包埋率降低。趙萌等[15]用海藻酸鈉和魔芋葡甘聚糖復(fù)配可提高微膠囊對(duì)益生菌的包埋率，并研究了魔芋葡甘聚糖分子質(zhì)量對(duì)包埋率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中等分子質(zhì)量的魔芋葡甘聚糖在機(jī)械強(qiáng)度、包埋率等均優(yōu)于海藻酸鈉微膠囊，且魔芋葡甘聚糖分子質(zhì)量增大時(shí)，包埋率也會(huì)提高。

圖1 魔芋葡甘聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effect of konjac glucomannan concentrationon the encapsulation efficiency of microcapsules注：不同小寫字母表示差異顯著，(P<0.05)。下同。

2.1.2 ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包埋率的影響

ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)包埋率的影響如圖2所示。從圖中可以看出，微膠囊的包埋率隨ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加，當(dāng)ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，微膠囊包埋率最大，當(dāng)ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加時(shí)，微膠囊包埋率降低。這主要由于當(dāng)ALG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高時(shí)，溶液黏度增大，益生菌不易分散；當(dāng)ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)，形成的凝膠顆粒小，機(jī)械強(qiáng)度低，不能有效包埋菌體，影響包埋效果。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從2%增大到4%時(shí)，微膠囊粒徑變大，這主要是由于溶液黏度增大，在攪拌時(shí)不利于乳化。ZHAO等[16]通過壓縮試驗(yàn)和動(dòng)態(tài)振蕩流變學(xué)結(jié)果均表明，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的微膠囊具有較高的力學(xué)強(qiáng)度。其原因可能是海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加導(dǎo)致固相體積分?jǐn)?shù)和交聯(lián)密度的增加，從而使微膠囊具有更高的硬度[17-18]。具有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳酸鈣微膠囊也有類似的趨勢(shì)。這可能是由于較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度提供了更多的Ca2+和海藻酸根交聯(lián)。

圖2 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentration onthe encapsulation efficiency of microcapsules

2.1.3 水油體積比對(duì)包埋率的影響

水油體積比對(duì)包埋率的影響如圖3所示。從圖中可以看出，油相不足時(shí)，包埋率較低，可能是由于乳化劑的含量較少，微膠囊的含量較高，在攪拌的過程中顆粒之間相互擠壓，使得微膠囊顆粒不易成型；水油體積比變小時(shí)，油相體積充足，分散空間比較寬松，壁材可以充分乳化并分散，形成微膠囊的粒徑比較均勻，有利于微膠囊包埋率的提高，通過顯微鏡可以觀察到微膠囊粒徑較小，經(jīng)過攪拌、離心以及洗滌等機(jī)械作用下，微膠囊極易破裂，最終導(dǎo)致包埋率較低[19]。

圖3 水油體積比對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of water phase and oil phase volumeratio on the encapsulation efficiency of microcapsules

2.1.4 CaCO3與ALG質(zhì)量比對(duì)包埋率的影響

CaCO3與ALG質(zhì)量比對(duì)包埋率的影響如圖4所示。從圖中可以看出，隨著CaCO3添加量的增加，微膠囊包埋率增加，當(dāng)CaCO3與ALG質(zhì)量比>1∶2時(shí)，雖然包埋率較高，但形成的顆粒粒徑較大，呈球性差；當(dāng)碳酸鈣與ALG質(zhì)量比<1∶5時(shí)，微膠囊包埋率降低，交聯(lián)劑濃度降低，顆粒不易成型，包埋率降低。SILVA等[20]用內(nèi)源乳化法將重組人胰島素包埋在海藻酸鈉中，考察了工藝參數(shù)對(duì)胰島素的形態(tài)和包封率的影響，發(fā)現(xiàn)CaCO3的濃度對(duì)胰島素的包埋率有顯著影響。SULTANA等[21]測(cè)定了不同濃度的海藻酸鈉和鋇鹽對(duì)微膠囊包埋率的影響，包埋率隨著聚合物濃度的增加而顯著提高，這可能是由于在聚合鏈中有更多的活性鋇結(jié)合位點(diǎn)，因此，隨著海藻酸鈉含量的增加，交聯(lián)程度也會(huì)提高。LEE等[22]證明了這一現(xiàn)象，即隨著海藻酸鈉濃度的增加可能獲得更高的載藥量，增加交聯(lián)劑的濃度也會(huì)增加載藥量。這可能是由于隨著鋇離子的增加，凝膠強(qiáng)度也隨之增加，聚合物的交聯(lián)性和形成的凝膠的致密性也提高了。這些結(jié)果與TAKKA等[23]和MIRGHANI等[24]的報(bào)道相一致。

圖4 碳酸鈣與海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.4 The influence of the mass ratio of CaCO3 to sodium alginate on the encapsulation efficiency of microcapsules

2.1.5 微膠囊最佳配方的確定

通過測(cè)定微膠囊的包埋率，進(jìn)行最佳配方篩選。以包埋率為試驗(yàn)指標(biāo)，極差越大表明該因素對(duì)指標(biāo)影響的因素越大。由表2可知，4種因素對(duì)包埋率影響大小依次為：C(水油體積比)>D(CaCO3與ALG質(zhì)量比)>B(KGM質(zhì)量分?jǐn)?shù))>A(ALG質(zhì)量分?jǐn)?shù))。因此，A2B1C2D1為最佳組合。但該組合未在試驗(yàn)之列，故需作進(jìn)一步驗(yàn)證工作。

表2 微膠囊配方篩選L9(34) 正交試驗(yàn)Table 2 The orthogonal experiment L9(34) result of screening microencapsulation

最佳配方的驗(yàn)證試驗(yàn)表明，A2B1C2D1組合的包埋率較高，達(dá)到(76.2±5.1)%，經(jīng)檢驗(yàn)A2B1C2D1的包封率顯著高于其他組(P<0.05)。且微膠囊呈球性好，粒徑較小。因此，選擇A2B1C2D1組合的微膠囊做后續(xù)試驗(yàn)。以包埋率為指標(biāo)，則ALG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，KGM的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，水油體積比1∶3， CaCO3與ALG的質(zhì)量比1∶3，為制備微膠囊的最佳配方。

2.1.6 微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)

通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察新制備和冷凍干燥的微膠囊，結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖可知，復(fù)合益生菌微膠囊具有一個(gè)光滑的表面和良好的分散性的規(guī)則球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑為(352.6±9.5)μm。微膠囊經(jīng)冷凍干燥后，呈蜂窩狀，表面褶皺，凹陷，仍維持球形外觀，這是冷凍干燥常有的現(xiàn)象。微膠囊結(jié)構(gòu)致密，是由于在冰醋酸的作用下，Ca2+釋放與海藻酸鈉形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。CHEN等[25]通過冷凍干燥顯著保留了益生菌的活性。掃描電鏡圖像證實(shí)了凍干后微膠囊的形貌得到了較好的保存，微膠囊適用于嚴(yán)酷的加工或消化條件，HOMAYOUNI等[26]認(rèn)為，微膠囊化主要是為了保護(hù)冰淇淋中的益生菌在加工過程中不受氧毒性和機(jī)械壓力的影響，從而保證了冰淇淋中益生菌的存活。

圖5 光學(xué)顯微鏡下微膠囊形態(tài)圖Fig.5 Morphology of microcapsules under optical microscope

a-放大80倍；b-放大200倍圖6 微膠囊掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy images of microcapsules

2.1.7 微膠囊模擬胃液中的耐受性

益生菌在模擬胃液中的存活率是確保菌體通過胃部定植腸道中發(fā)揮益生功能的保障。由圖7可知，自由菌在模擬胃液中的存活率非常低，60 min后的存活率為(41.32±2.5)%，經(jīng)過120 min后，檢測(cè)不到活菌。微膠囊組在模擬胃液處理120 min后益生菌存活率仍為(45.65±5.0)%。結(jié)果表明，微膠囊可提高益生菌在酸性環(huán)境中的存活率。這可能是由于微膠囊結(jié)構(gòu)致密，孔徑較少，機(jī)械強(qiáng)度高，能較好地抵御胃液滲透，從而可以提高益生菌的存活率。微膠囊在水相中的收縮行為決定了外部溶液對(duì)內(nèi)部包封劑的影響。微膠囊在胃液中收縮的潛在機(jī)制較復(fù)雜，可能的解釋有：(1)微膠囊在胃液中收縮，是由于滲透壓改變；(2)在酸性條件下，海藻酸鏈羧基質(zhì)子化，由于靜電斥力減弱，導(dǎo)致海藻酸鈉收縮[16]。KRASAEKOOPT等[27]研究表明，只有微囊化的益生菌才能在胃腸道條件下維持生存，以海藻酸鈉為壁材的益生菌微膠囊已經(jīng)被證明可以提高益生菌在模擬胃條件下的生存能力。DE CASTROCISLAGHI等[28]研究了在pH值3.0和2.0條件下，自由菌和微膠囊化雙歧桿菌的存活率，在pH值為3.0時(shí)，自由菌和微膠囊化雙歧桿菌的存活率沒有顯著差異。然而，在pH值為2.0時(shí)，自由菌比微膠囊化雙歧桿菌存活率下降的更大。

圖7 模擬胃液中益生菌的存活率Fig.7 The survival rate of probiotics in simulatedgastric juice

2.1.8 微膠囊在模擬腸液中的釋放試驗(yàn)

圖8 微膠囊化益生菌在模擬腸液中的釋放曲線Fig.8 Release of microspheres containing probioticsin simulated intestinal juice

2.1.9 微膠囊在模擬連續(xù)的胃腸道試驗(yàn)

益生菌要對(duì)人體發(fā)揮其益生作用，除能抵抗胃酸的環(huán)境外，還需在到達(dá)腸道時(shí)保持一定存活量。由表3可知，自由菌在模擬腸液中處理60 min后，未檢測(cè)到活菌。而微膠囊化的益生菌活菌數(shù)仍達(dá)到(7.57±0.05) lg CFU/g，說明微膠囊既能抵抗胃酸的環(huán)境，還對(duì)膽鹽有一定的耐受性。在腸液中微膠囊化益生菌存活率低于胃液中，這主要是由于微膠囊在胃液和腸液中溶脹性不同。在胃液中，微膠囊收縮的原因可能有兩方面：一是形成的海藻酸鈣凝膠是耐酸性多聚物，在酸性的環(huán)境下也能夠使其較完整；另一方面，它可能是存在于胃液中的H+進(jìn)一步促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成微膠囊[29]，有效防止H+進(jìn)入微膠囊中損害益生菌；在模擬的腸液中，微膠囊溶脹的原因可能為海藻酸鈣的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)很難在中性環(huán)境下維持，溶液的滲透壓使微膠囊迅速吸收和溶脹，從而導(dǎo)致微膠囊的結(jié)構(gòu)損壞；此外，由于磷酸根的存在，導(dǎo)致微膠囊瓦解，因此，不能有效保護(hù)益生菌。圖9為微膠囊在模擬胃腸道中的形態(tài)圖。

表3 模擬連續(xù)的胃腸道中益生菌存活量 單位:lgCFU/g

a-新鮮微膠囊;b-胃液浸沒120 min后的微膠囊;c-腸液浸沒60 min后的微膠囊圖9 光學(xué)顯微鏡下微膠囊形態(tài)圖Fig.9 Optical images of microscopes

2.2 微膠囊對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

2.2.1 微膠囊的安全性評(píng)價(jià)

內(nèi)源乳化法制備的微膠囊灌胃小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將小鼠喂養(yǎng)6周，在此期間，小鼠的體重增長(zhǎng)正常，且各組期間均無死亡。精神狀態(tài)、體毛、飲食、排便狀況均無異常，經(jīng)過解剖小鼠，肉眼觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與對(duì)照相比，均未出現(xiàn)異常變化。表明制備的微膠囊不存在安全隱患，使用安全。

2.2.2 小鼠體重增加量和飼料利用效率

小鼠喂養(yǎng)6周后，各組小鼠的體重變化如圖10-a所示，小鼠的體重總體呈增加趨勢(shì)，各組相比均無顯著性差異(P>0.05)。由圖10-a可知，試驗(yàn)組小鼠體重增加量明顯高于對(duì)照組，表明微膠囊對(duì)小鼠體重增加有一定影響。小鼠的飼料利用效率如圖10-b所示，ALG組和ALG+KGM組的飼料利用效率高于對(duì)照組，但3組之間均無顯著性差異[30](P>0.05)。

a-體重增加量；b-飼料利用率圖10 各組小鼠體重增加量和飼料利用效率Fig.10 Weight gain and feed efficiency in each group of mice

2.2.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

通過血清指標(biāo)檢測(cè)，可有效判斷小鼠各組組織器官的病變情況。由表4可知，各組小鼠ALT、HDL-C、AST、TG、TC-C、TP、ALB與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。各組血清指標(biāo)檢測(cè)正常，表明微膠囊對(duì)小鼠各組器官無影響。測(cè)定酶活性是反映臟器損害最敏感的指標(biāo)之一，在一定的范圍內(nèi)，能夠定量評(píng)價(jià)臟器損傷的程度。酶活性的改變，通常出現(xiàn)在形態(tài)學(xué)改變之前，所以測(cè)定臟器酶活性的變化，能夠看出藥物對(duì)臟器的損害程度。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)是檢測(cè)肝細(xì)胞損傷的傳統(tǒng)指標(biāo)。由表中可看出，試驗(yàn)各組的酶活力與對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明微膠囊對(duì)小鼠的肝臟、腎臟功能沒有影響。

表4 各組小鼠血清生化指標(biāo)Table 4 Effect of CV on the levels of serum biochemical parameter in mice

2.2.4 肝臟、腎臟組織病理學(xué)觀察

小鼠肝臟、腎臟染色及顯微鏡觀察顯示，各組小鼠肝臟、腎臟均未見異常改變?nèi)鐖D11、圖12所示。鏡下可見肝細(xì)胞無腫脹，邊界清楚，肝小葉邊界清晰，血竇內(nèi)無充血，亦無異常細(xì)胞出現(xiàn)。腎臟皮質(zhì)區(qū)可見腎小體毛細(xì)血管無異常改變，管壁細(xì)胞無腫脹，球囊界限清晰。綜上所述，肝臟、腎臟均無任何特異性病理改變。

a-對(duì)照組;b-ALG；c-ALG+KGM圖11 各組肝臟組織病理切片圖Fig.11 Histological section of liver in each group of mice

a-對(duì)照組;b-ALG；c-ALG+KGM圖12 各組腎臟組織病理切片圖Fig.12 Histological section of kidney in each group of mice

2.2.5 微膠囊對(duì)小鼠腸道菌群的影響

小鼠腸道菌群門水平上相對(duì)豐度如圖13所示，擬桿菌門和厚壁菌門是3組中占主導(dǎo)地位的2個(gè)菌門，平均占總序列的90%以上。由圖13-b可知，灌胃KGM后，乳桿菌科的相對(duì)豐度升高，脫鐵桿菌科、脫硫弧菌科等有害菌的相對(duì)豐度降低，說明魔芋葡甘聚糖能夠促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌，進(jìn)一步證實(shí)魔芋葡甘聚糖確實(shí)具有顯著的腸道益生作用，有助于促進(jìn)腸道健康。

a-門水平上的相對(duì)豐度;b-科水平上的相對(duì)豐度圖13 小鼠腸道菌群相對(duì)豐度Fig.13 Relative abundance of intestinal flora in mice注：1，對(duì)照組；2，ALG組；3，ALG+KGM組

3 結(jié)論

以包埋率為指標(biāo)，通過優(yōu)化制備條件，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的海藻酸鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的魔芋葡甘聚糖、水油體積比為1∶3、CaCO3與ALG質(zhì)量比為 1∶3的條件下，制得微膠囊的包埋率為(76.2±5.1)%。經(jīng)過包埋后的益生菌在模擬胃液中處理120 min后存活率仍為(45.65±5.0)%，表明微膠囊具有良好的耐酸性。微膠囊在腸道中具有良好的釋放性，在腸液中處理60 min后，活菌數(shù)達(dá)到(2.24±0.98)×109CFU/g。在模擬連續(xù)的胃腸道試驗(yàn)中，微膠囊化的益生菌的活菌數(shù)仍能達(dá)到(3.72±0.41)×107CFU/g，說明微膠囊不僅能夠提高益生菌在胃液中的存活率，還能夠增強(qiáng)微膠囊對(duì)膽鹽的耐受性。通過血清生化指標(biāo)，組織病理切片，證明該材料對(duì)小鼠無毒性，可安全使用。將含有KGM的微膠囊灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)魔芋葡甘聚糖具有一定益生作用。

本文研究結(jié)果不僅為益生菌微膠囊的工藝優(yōu)化提供了理論和實(shí)踐依據(jù)，且為魔芋葡甘聚糖作為壁材使用及利用其益生作用奠定了基礎(chǔ)。